Adropin在慢性心力衰竭中的作用机制研究

【摘要】：目前心力衰竭的治疗方案包括拮抗神经内分泌系统的激活,比如β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制、血管紧张素受体拮抗剂、醛固酮拮抗剂等药物,对症治疗,比如利尿剂、强心甙等药物,以及机械辅助治疗。虽然心力衰竭的治疗措施已经取得了长足发展,但心力衰竭的患病率和死亡率仍居高不下,晚期心力衰竭患者人数在逐年增多,这些患者需要新的治疗策略来改善他们的预后。 正常心脏依靠线粒体氧化磷酸化生成的大量ATP来维持自身舒缩功能,其中约60-90%的ATP来自脂肪酸氧化,10-40%的ATP来自乳酸盐和葡萄糖。既往动物和临床研究证实心力衰竭时心肌能量代谢出现异常,转变心肌底物代谢模式能改善心室功能,减缓心力衰竭患者左心室功能障碍的发生。心肌能量代谢调节有望成为一种新型的心力衰竭治疗手段。 Adropin是2008年由Kumar等在研究下丘脑性肥胖小鼠肝脏基因表达时发现的一种由76个氨基酸构成的分泌性蛋白,它由能量动态平衡相关基因(Enho)编码,后者在肝脏、脑部、脐静脉和冠状动脉内皮细胞都有表达。肝脏Enho表达受机体能量代谢状态和摄取食物中的营养成分组成调节,在肥胖状态下发生改变。转基因过表达或重组adropin治疗能改善进食诱导的肥胖模型胰岛素抵抗和葡萄糖耐量受损。Adropin能减弱与肥胖相关的代谢紊乱,而肥胖易与高血压病、胰岛素抵抗、血脂异常等集结出现,是心力衰竭的独立危险因素,据此,我们推测adropin可能参与了心力衰竭的病理生理过程。本研究主要探讨adropin与心力衰竭的关系及其对心肌细胞的作用,希望找到一个以adropin作为靶点的新的心力衰竭能量代谢治疗方法。 第一部分:慢性心力衰竭患者外周血adropin水平的变化及意义 目的:探讨慢性心力衰竭患者外周血adropin水平的变化及其临床意义。 方法:根据最新ACC/AHA慢性心力衰竭诊断和治疗指南,入选56例慢性心力衰竭患者和20例健康对照者;用ELISA法测adropin、TNF-α、IL-6水平;同时采用RIA法检测BNP水平;用全自动生化分析仪测血糖、血脂、肝肾功能;测量患者身高、体重,计算体重指数;超声检测心脏功能。 结果:心力衰竭组LVEF随着NYHA心功能分级的加重而降低,BNP浓度随着NYHA心功能分级的加重而明显增高,BNP与LVEF负相关(r=-0.889,p0.001)。在NYHAⅣ级的心力衰竭组,IL-6和Cr比对照组明显增高(p0.05,p0.05),而TC和LDL-C比对照组降低(p0.01,p0.05)。以NYHA心功能分级的3组心力衰竭组及正常对照组间adropin水平差异显著(p0.001):血浆adropin水平随着心功能的恶化而升高,对照组:6.0±0.3 ng/mL;NYHAⅡ:7.6±0.4 ng/mL;NYHAⅢ:9.8±0.5 ng/mL; NYHAⅣ:12.4±0.6 ng/mL。慢性心力衰竭患者adropin水平与血浆BNP水平成正比(r=0.723,p0.001),与血浆IL-6水平成正比(r=0.326,p0.01),与血浆Cr水平成正比(r=0.238,p0.05),与BMI成正比(r=0.295,p0.05)。血浆adropin水平与LVEF负相关(r=-0.710,p0.001)。多元线性回归分析表明,血浆BNP和BMI是心力衰竭患者血浆adropin水平的主要影响因素。 结论:慢性心力衰竭患者血浆adropin水平随着心功能的恶化而增高。多元线性回归分析证实BNP和BMI是血浆adropin水平的主要影响因素。这些发现表明慢性心力衰竭患者释放到血液中的adropin增多可能参与了心力衰竭发展的病理生理过程,但是具体的机制需要进一步的研究。 第二部分:重组adropin对缺血性心力衰竭大鼠模型心功能的影响 目的:检测缺血性心力衰竭大鼠模型外周血adropin水平的变化;观察重组adropin注射2周后对缺血性心力衰竭大鼠模型心功能的影响。 方法:采用50只SD大鼠分为实验组(n=40)和假手术组(n=10),实验组大鼠通过前降支结扎至心肌梗死的方法构建心力衰竭模型,并经超声证实,术后2周分为早期干预组和晚期干预组,每组再分为生理盐水治疗组(n=6)和adropin治疗组(n=6),adropin治疗组腹腔注射adropin 100ug/kg/d,生理盐水治疗组腹腔注射同等量生理盐水,治疗2周后进行各项检测。检测早期干预组的生理盐水治疗组和假手术组大鼠术前及术后24h、3d、2w、4w的adropin水平;早期干预组大鼠治疗2周后处死,进行心肌病理组织学检测,用TUNEL试剂盒进行细胞凋亡检测;晚期干预组大鼠治疗2周后进行超声检测大鼠心脏左室舒张末直径(LVEDD)、左室收缩末直径(LVESD)、左室舒张末容积(LVEDV)、左室收缩末容积(LVESV)和左室射血分数(LVEF)。 结果:早期干预组与假手术组相比,术后24小时adropin水平显著下降(3.22±0.24ng/mL vs 5.60±0.16ng/mL, p0.01),术后3日adropin水平较假手术组升高,但是不明显,直到术后4周较假手术组明显增加(8.06±0.15ng/mL vs 5.96±0.15ng/mL, p0.01);在早期干预组中，生理盐水治疗组心肌变性坏死明显，而adropin治疗组虽有心肌变性坏死,但程度明显降低;③在早期干预组中,生理盐水治疗组TUNEL阳性细胞率明显高于adropin治疗组(39.8±8.2% vs 4.67±2.2%, p0.01, n=6);③在晚期干预组中,adropin治疗组与生理盐治疗组相比,大鼠心脏LVEF明显改善(48.72±6.58% vs 35.52±2.05, p0.01, n=6)。 结论:心梗后大鼠血清adropin水平早期即出现波动,有短期内先下降而后持续上升特点,进入心力衰竭期后水平进一步升高。重组adropin治疗2周后明显减轻心梗后心肌变性坏死和细胞凋亡,改善缺血性心力衰竭大鼠的心功能。 第三部分:Adropin对心肌细胞肥大、凋亡的作用及其机制 目的:观察:①adropin对缺氧诱导心肌细胞肥大和凋亡的影响;②adropin对乳鼠原代心肌细胞AMPK信号通路活化的作用。 方法:MTT法检测不同浓度adropin的干预对乳鼠原代心肌细胞在缺氧条件下细胞存活率的影响;Bradford法检测不同浓度adropin的干预对心肌细胞蛋白含量和合成速度的影响;Westernblot检测缺氧条件下adropin干预对乳鼠原代心肌细胞0～4小时p-AMPK水平变化的影响;Annexin V-FITC检测adropin对缺氧条件下乳鼠心肌细胞凋亡的影响。 结果:与对照组相比,10~(-8)~10~(-6)mol/L的adropin干预后可显著提高心肌细胞在低氧条件下的存活率(p0.01),并呈浓度依赖性;与对照组相比，10~(-6)mol/L adropin干预可明显抑制低氧诱导的心肌细胞总蛋白含量和合成速度增高(p0.01);与无血清组相比,adropin组细胞凋亡率无明显改变(p=0.12),但是adropin+缺氧组凋亡率较缺氧组显著降低(p0.01),加入p-AMPK抑制物compound c后adropin+缺氧组凋亡增加,与缺氧组相比无显著差异;④10~(-6)mol/L的adropin干预可使体外培养的乳鼠心肌细胞p-AMPK水平较对照组增高(p0.01)。 结论:Adropin可增加缺氧条件下心肌细胞的活性,抑制细胞肥大,提高心肌细胞的p-AMPK水平,并通过AMPK通路抑制心肌细胞凋亡。