miR-223在胰腺癌发病中的作用研究

【摘要】：胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一种较常见的、恶性程度极高的消化系统肿瘤。近年来,胰腺癌在全球的发病率呈逐年上升趋势。据统计,美国2009年新增胰腺癌病人约42,470例,其中大约有83%的病人于1年内死亡,胰腺癌仅占癌症总人数的2%-3%,但其死亡率却位居肿瘤死因的第4位;在中国,近20年来胰腺癌发病率增长了将近6倍,居恶性肿瘤死亡率的第5位。由于胰腺位置隐蔽,早期发现困难,传统的放疗、化疗、手术治疗对胰腺癌治疗的临床应用价值较小,因此胰腺癌的发病形势日益严峻,且死亡率一直居高不下。虽然目前国内外对胰腺癌的生物学标志进行了大量而广泛的研究,包括细胞学标记、血清学标记和基因标记等,但是由于这些指标的特异性和敏感性不同,利用这些免疫标记物进行诊断仍有很多不足,需要有对胰腺癌有更好诊断意义的临床指标。 近来,一类在转录水平上调控基因表达的非蛋白编码microRNAs(miRNAs)的发现,给胰腺癌的研究带来了新的希望。miRNA是一类含19-23个核苷酸非编码小分子RNA,广泛存在于真核生物中,目前被miRBase收录的人类miRNA有近700种,其中大部分miRNA在不同的生理和病理情况下进行表达~([1])。大量研究发现miRNAs与肿瘤的发生发展密切相关,被认为是一组新的致癌基因或抑癌基因~([2-7])。尽管miRNA的功能尚待阐明,但通过对其表达谱的研究发现miRNA具有很强的细胞、组织或疾病特异性,这些特异表达的microRNA既是其功能研究的基础,又可以作为很好的疾病诊断标志物~([8]),上述研究提示miRNA可作为肿瘤等疾病的潜在标志物。 目前研究表明,胰腺癌的细胞和组织中有许多基因发生了突变,如IGF、Notch、K-Ras、MUC、PI3K-AKT和Sonic Hedgehog等。这些突变因子主要归于3条重要信号转导通路:PI3K-AKT-mTOR信号通路、Ras-MAPK信号通路和Hedgehog信号通路。Hedgehog(Hh)信号转导通路的异常激活或成员突变可以导致胰腺癌等肿瘤的发生,Glil(Glioma-associated Oncogene Homolog l,Glil)是最初在研究神经胶质瘤时发现并命名的一个基因,其编码的Glil蛋白是Hh信号途径最重要的下游转录因子之一,同时也是Hh信号最终的响应者和功能的执行者,SUFU的作用靶点位于Smo下游的GLI因子,在哺乳动物中抑癌基因SUFU是Hedgehog信号通路的主要负性调节因子。有研究发现miRNA可以对Hedgehog信号通路因子进行调控参与Hedgehog信号通路的活化以及肿瘤发生。 本研究通过检测胰腺癌组织中miR-223的表达探讨其在胰腺癌疾病中改变以及潜在的诊断价值,并利用real time RT-PCR技术检测GLI1、SUFU基因在胰腺癌旁组织、胰腺癌组织中mRNA水平上相对表达量,比较之间的表达差异,进而分析miR-223与胰腺癌发病相关的Hedgehog信号通路的相关性,为胰腺癌的诊断提供重要的依据。本研究包括三部分内容,分述如下。 一、人血浆芯片筛选的高表达miRNA在胰腺癌细胞及组织中的表达检测 目的:检测验证在7株胰腺癌细胞株中miRNA-223及胰腺癌组织及相应癌旁组织中7个miRNA(miR-20a、miR-26a、miR-142-3p、miR-1202、miR-1207-5p、miR-1228、miR-223)的表达情况。 方法和材料:收集10例手术切除的胰腺癌组织及其对应的癌旁组织和3例正常胰腺组织,7株胰腺癌细胞株为长海医院消化内科实验室保存。采用TaqMan Real-time PCR方法,以正常胰腺组织或293细胞株作为对照,以U6为内参,检测7个miRNA在上述标本中的表达情况。 结果:以正常胰腺组织或293细胞株作为对照,以U6为内参,7个miRNA在胰腺癌组织的表达较其对应的癌旁组织中的表达均无显著差异(P0.05),只有miRNA-223在胰腺癌组织中的表达量(3.55±3.73)有高于其对应的癌旁组织(2.67±1.94)的趋势(P=0.445),其余6个miRNA在胰腺癌组织中的表达量低于或近似对应的癌旁组织;miR-223在胰腺癌细胞株BXPC-3的表达量最高(61.07±16.16)显著高于293细胞株(P0.05)。 结论:通过筛选,只有miR-223有在胰腺癌组织中高表达的趋势,其余6个miRNA在胰腺癌组织及对应的癌旁组织中变化不大,miR-223可能在胰腺癌发生发展中起一定作用。 二、人胰腺癌组织中miR-223的表达与临床病理特征间的相关性分析 目的:分析胰腺癌及其配对癌旁组织中miR-223的表达差异,并分析其与胰腺癌临床病理参数的关系,评价miR-223对胰腺癌潜在的诊断价值。 方法和材料:收集我院50例胰腺癌患者手术标本的癌组织及配对的癌旁组织,3例正常胰腺组织作为对照。采用TaqMan Real-time PCR方法,以U6为内参,检测miR-223在胰腺癌及配对癌旁组织中的相对表达量,并分析其与胰腺癌临床病理参数的关系。 结果:以正常胰腺组织为参照,表达量以中位数和四分位数表示,胰腺癌组织中miR-223的表达量为3.47(1.53,6.03),胰腺癌癌旁组织中miR-223的表达量为1.52(0.61,3.25),两组之间存在显著差异(p=0.011),胰腺癌中miR-223的高表达和胰腺癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤最大径、临床分期、局部淋巴结转移、远处转移和CA19-9浓度等肿瘤临床特征无关(p0.05)。 结论:胰腺癌组织中miR-223表达量显著高于癌旁组织及正常胰腺组织,提示miR-223可能在胰腺癌发生发展中起一定作用,并对胰腺癌有潜在的诊断价值。胰腺癌组织miR-223表达量和胰腺癌生物学特性间关系分析表明,miR-223的表达量与胰腺癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤最大径、临床分期、局部淋巴结转移、远处转移和CA19-9浓度无相关性,表明胰腺癌组织中miR-223异常高表达可能为肿瘤发生的早期事件。由于血清CA19-9与肿瘤最大径、临床分期有关,在早期胰腺癌中敏感性较低,miR-223在各肿瘤分期中的稳定性表明其作为肿瘤标志物可能对血清CA19-9有一定的补充诊断价值。 三、人胰腺癌组织中miR-223表达与Hedgehog通路中SUFU、GLI1表达相关性分析 目的:检测胰腺正常组织、胰腺癌组织及其配对的癌旁组织中GLI1、SUFU基因在mRNA水平上的表达,分析GLI1、SUFU基因转录变化与miR-223表达变化的相关性及其与胰腺癌发病的作用。 方法和材料:收集我院46例胰腺癌患者手术标本的癌组织及配对的癌旁组织,3例正常胰腺组织作为对照。采用TaqMan Real-time PCR方法,以GAPDH为内参,检测GLI1、SUFU基因在mRNA水平上的表达变化,并分析其与miRNA-223相对表达量之间的关系。 结果:以正常的胰腺组织为参照,表达量以中位数和四分位数表示,胰腺癌组织中GLI1mRNA表达量为4.81(1.21,10.10),胰腺癌癌旁组织的表达量为1.99(0.68,5.56),两组之间存在显著差异(P=0.042)。胰腺癌组织中SUFU mRNA表达量为1.23(0.80,2.29)胰腺癌癌旁组织的表达量为1.72(1.11,2.48),两组之间无显著差异(P=0.40),胰腺癌癌旁组织中GLI1mRNA表达量与miR-223在胰腺癌癌旁组织中的表达量之间存在一定程度的相关性(r=0.432,p=0.005)。GLI1、SUFUmRNA在胰腺癌组织中的表达量与miR-223在胰腺癌表达变化无明显相关性(P0.05)。 结论:GLI1mRNA在胰腺癌组织中较对应的癌旁组织中的表达量增高,参与了胰腺癌的产生。胰腺癌癌旁组织中GLI1mRNA表达量与与miR-223在胰腺癌癌旁组织中的表达量之间存在一定程度的相关性,表明GLI1基因及miR-223在胰腺癌的发生中可能起到一定的协同作用。