自噬在肝癌起始期和发展期的不同作用及机制研究

【摘要】：【研究背景及目的】 原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤，位居全球肿瘤发病率第六位，致死率第三位。而我国更是肝癌高发区，肝癌死亡率占恶性肿瘤死因的第二位。目前的研究表明，肝癌的发生是个多因素多步骤的长期而复杂的过程，各种致病因素导致的慢性肝损伤是肝癌发生的主要基础。在这一过程中，致癌因素和肝脏各机制之间如何相互作用最终导致肝癌发生，始终是研究的热点。在已知肝癌发生相关因素中，大自噬（marcoautophagy，以下简称自噬）获得了越来越多的关注。 自噬是进化过程中高度保守又广泛存在的一种依赖于溶酶体的自我消化和胞内再循环的机制。自噬先通过形成自噬小体包裹底物，再运输自噬小体至溶酶体处与其融合，从而降解底物。自噬对于细胞稳态的维持至关重要，是细胞处于不利环境时重要的自我保护机制。这使自噬与包括肿瘤在内的众多病理现象具有十分紧密的联系。有研究表明抑制自噬能够加速多种肿瘤的形成。但同时，也有研究显示，抑制自噬能减缓多种原癌基因介导的肿瘤发生。而且自噬还被证实能够帮助肿瘤细胞适应恶劣的微环境。这些研究使得自噬在肿瘤发生中的作用充满了矛盾性。肿瘤发生发展的多步骤性是导致这种现象的一个可能的原因。 在肿瘤的发生发展中，众多损伤因素刺激导致的遗传学和表观遗传学的改变，起始并推动了正常细胞逐渐向肿瘤细胞转化。简单的划分这一演化过程，可以分为起始期和发展期两个阶段。在起始期，正常细胞逐渐演化为初期肿瘤细胞，通常表现为异常而缓慢的持续增殖。而在发展期，初期肿瘤细胞在致癌因素的持续作用下，进一步演化形成恶性肿瘤细胞，最终导致肿瘤的生成。自噬作为一种保护机制，与多种影响肿瘤发生发展的因素相关。而在肿瘤发生发展的不同阶段，随着细胞的逐渐转化，以及细胞周围微环境的变化，自噬对于肿瘤发生发展这一整个过程而言，发挥的主要作用很可能有所不同，从而使得自噬在肿瘤发生发展中表现出两面性的特点。 本课题我们采用二乙基亚硝胺（DEN）诱发SD大鼠肝癌，在肝癌起始期和发展期分别利用氯喹（CQ）抑制自噬，观察在不同时期抑制自噬对肿瘤发生的影响，并分别在肝癌起始期和发展期研究抑制自噬起到的作用及其机制，为人们更好的了解自噬在肿瘤发生中的作用及抗自噬手段在肿瘤及其相关疾病中更合适的应用提供实验基础。 【实验方法】 1、建立DEN诱导大鼠肝癌发生的模型，通过对其过程的连续观察及区分不同诱癌时间对肿瘤发生的影响，划分肝癌起始期和发展期。 21、利用Western blot（WB）、电镜检测等方式，研究DEN对大鼠肝脏细胞自噬的影响，以及腹腔注射CQ对体内肝细胞自噬的抑制效果。 3、在DEN诱发的大鼠肝癌的起始期和发展期分别利用腹腔注射CQ抑制自噬，并在合适的时间点处死大鼠，通过对各组大鼠发瘤率、最大肿瘤体积及肿瘤数量的统计，分析在肝癌起始期和发展期抑制自噬对肝癌发生的不同影响。 4、利用免疫组化、Tunel染色、WB及qPCR等方法，研究抑制自噬对DEN诱导的大鼠肝细胞凋亡、增殖、DNA损伤和炎症因子表达等肝癌发生相关因素的影响。 5、利用直接或间接的活性氧（ROS）含量相关指标，检测自噬对DEN诱癌大鼠的肝细胞中ROS累积的影响。 6、利用抗氧化剂BHA消除ROS，检测在肝癌起始期时，ROS的累积与抑制自噬的促瘤作用的相关性。 7、利用WB、电镜等方式验证肝癌发展期CQ对肝癌细胞自噬的影响，并利用免疫组化和WB的方式，研究自噬抑制对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。 8、检测抑制自噬对肿瘤细胞的ROS累积的影响，并利用BHA检测抑制自噬在肝癌发展期的抑瘤作用与ROS累积的相关性。 9.通过检测三羧酸循环的关键中间产物柠檬酸、异柠檬酸和乙酰辅酶A，以及ATP的含量，分析自噬抑制对肝癌组织中细胞代谢的影响 【实验结果】 1、将DEN诱癌开始到第9周划分为肝癌起始期，第10到17周划分为肝癌发展期。在肝癌起始期抑制自噬起到了促进肿瘤发生的作用，而在发展期抑制自噬则起到了抑制肿瘤发生的作用。 2、DEN能够诱导大鼠肝脏细胞自噬的发生，而CQ可以对其进行抑制。 3、抑制自噬虽然没有影响DEN诱导的大鼠肝细胞死亡，但显著促进了细胞增殖、DNA损伤和肝癌发生相关炎症因子IL-1β, TNFα和IL-6的表达。 4、抑制自噬促进了DEN诱癌大鼠肝细胞中ROS的累积。 5、在肝癌起始期用BHA清除ROS，抵消了抑制自噬对细胞增殖、DNA损伤、炎症因子表达的促进作用，并最终逆转了肝癌起始期抑制自噬的促瘤作用。 6、在肝癌发展期，CQ能够抑制肿瘤细胞的自噬，而且自噬的抑制导致肿瘤细胞增殖减少、凋亡增多。 7、抑制自噬同样加剧了肝癌细胞ROS的累积，但ROS的累积只是参与了抑制自噬导致的细胞凋亡，而且这种细胞凋亡的增多也有不依赖于ROS的因素。 8、抑制自噬显著的抑制了肝癌细胞的代谢。 【结论】 本研究发现，自噬在DEN诱导的大鼠肝癌发生过程的不同时期对肿瘤发生具有不同的影响，在肝癌起始期自噬能够抑制肿瘤发生，而在肝癌发展期自噬反而起到促进肿瘤发生的作用。在肝癌起始期，自噬通过抑制肝细胞增殖、减少DNA损伤和炎症因子表达，发挥抑制肿瘤的作用。自噬对肝细胞中ROS累积的抑制，在这一过程中发挥关键作用。而在肝癌发展期，自噬通过支持肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡，起到促瘤的作用。自噬通过减少过多的ROS累积导致的细胞死亡，以及对细胞代谢的支持在其中发挥作用。在肝癌的起始期和发展期，自噬分别对肝细胞和肝癌细胞发挥了保护作用，从而导致了它对肿瘤发生的作用的变化。