新的内毒素结合蛋白CRISPLD2在脓毒症中的表达及其意义

【摘要】：脓毒症是危重症患者常见并发症，其病理生理过程复杂,牵涉全身各个器官。尽管各类广谱抗生素的应用，新的治疗方法不断出现，脓毒症患者死亡率依然居高不下，是困扰急诊和重症医学医生的重大难题。重组活化蛋白C（drotrecogin alfa, arecombinant activated protein C）以及eritoran tetrasodium （a novel anti–Toll-likereceptor (TLR)-4compound）虽然在1期和2期临床试验证实有效，最近的3期临床实验中未发现明确的治疗效果，重要的原因就是缺少合适的标志物分层，判断哪些患者受益于治疗。因此，寻找合适的生物标志物对于诊断和治疗脓毒症非常重要。 导师组王志勤教授等前期工作发现半胱氨酸富集的分泌蛋白含有两个LCCL结构域(CRISPLD2/Crispld2)，亦是内毒素结合蛋白，具有很好的结合内毒素的亲和力。内毒素同CRISPLD2的亲和力同CD14、 MD2近似，高于TLR4，低于LBP。体内发现内毒素刺激外周单个核细胞能够促进CRISPLD2的分泌，动物实验提示内毒素腹腔注射后24小时内CRISDPLD2蛋白水平下降，24小时后迅速反弹，5-7天到达高峰，随后缓慢下降，维持2周左右。而重组CRISPLD2蛋白抑制内毒素同靶细胞结合，减轻炎症反应，降低TNF-α和IL-6的水平，保护内毒素休克小鼠。人血清（浆）CRISPLD2水平高于LBP, soluble CD14等。值得注意的是婴儿脐带血CRISPLD2水平明显低于成年人。总之，CRISPLD2在脓毒症病理生理过程中起着重要作用。以往的研究使用LPS诱导的内毒素休克模型，并没有反映真正的多种细菌感染的临床状态，盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型已被广泛用于实验性研究，并且被认为是模仿人类多种细菌感染造成的脓毒症一个可靠的模型。盲肠结扎的范围、穿刺针孔大小及穿刺次数等可以制作不同程度的脓毒症，死亡率亦有很大差别。最近发现CRISPLD的R3H结构域，可以与寡核苷酸绑定在一起，已有实验证明CpG寡核苷酸（ssCpGDNA）可以使实验动物免于细菌感染。我们研究发现，CRISPLD2包含一个RAAIH（R3H）结构，目前还没有资料表明CRISPLD2是否结合单链DNA。糖皮质激素（Glucocorticoid）受体可以和CRISPLD2基因启动区特定DNA序列(GRE)结合。 基于上述背景，我们提出以下假设：CRISPLD2也是一个ss DNA结合蛋白，多种微生物抗原促进CRISPLD2分泌；上调血清CRISPLD2水平保护脓毒症老鼠（CLP)；糖皮质激素调控CRISPLD2表达，可能与糖皮质激素保护脓毒症的作用机制相关；CRISPLD2可能成为临床脓毒症患者新的生物标志物。 本研究的第一部分，我们证实CRISPLD2不仅是一个内毒素结合蛋白亦是一个单链DNA结合蛋白，多种微生物抗原如ssCPG-DNA、PGN、ssGPC-DNA和双链RNA（PolyI：C）等可以刺激外周单个核细胞分泌CRISPLD2；CRISPLD2与内毒素结合抑制后者同靶细胞结合，而其与单链DNA的结合并不阻断后者与靶细胞结合。 本研究的第二部分，我们利用脓毒症盲肠结扎穿孔动物模型探讨CRISPLD2在脓毒症中的表达规律及以其为靶点治疗脓毒症的可行性。脓毒症大鼠急性期的高死亡率同过度的炎症反应以及CRISPLD2的未能及时上调相关。预注射内毒素可以上调CRISPLD2水平，同降低脓毒症小鼠的死亡率相关。重组CRISPLD2蛋白的静脉注射上调血清CRISPLD2水平，降低脓毒症死亡率。糖皮质激素上调正常大鼠CRISPLD2水平，小剂量糖皮质激素上调脓毒症大鼠CRISPLD2水平同降低脓毒症大鼠死亡率相关，中到大剂量糖皮质激素未能提高血清CRISPLD2水平，未能降低脓毒症大鼠死亡率。 本研究的第三部分，我们首先检测CRISPLD2的表达情况，正常水平为221.39±61.50ug/ml，在脓毒症时其水平明显上升，而在感染性休克时其水平上升受到限制，显著低于正常水平及脓毒症患者水平。在脓毒症患者中，CRISPLD2水平同病情程度评分APACHEII及SOFA明显相关，同炎症指标PCT相关。 综上所述：CRISPLD2不仅是一个内毒素结合蛋白，亦是一个ssCPG-DNA结合蛋白；在脓毒症大鼠CLP模型中，严重的感染伴随低水平CRISPLD2与高死亡率相关；通过腹腔预注射内毒素或者静脉注射重组CRISPLD2，提高血清CRISPLD2水平，与降低脓毒症小鼠死亡率相关；糖皮质激素调控大鼠CRISPLD2水平，小剂量激素促进CRISPLD2分泌，降低脓毒症大鼠死亡率；大剂量激素虽然提升正常大鼠CRISPLD2水平，但未能提升脓毒症大鼠CRISPLD2水平，降低死亡率；CRISPLD2在正常人中呈现正态分布，波动幅度较大，在中低度脓毒症时其水平明显上升，在重度脓毒症时其水平未能上调。