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转录因子NF-kB信号通路在胰腺炎发生中的机制研究

黄浩杰  
【摘要】:研究背景 胰腺炎是胰腺的一种炎症性疾病导致高发病率和死亡率。目前主要以对症治疗为主。由于缺乏对于细胞病理生理早期重要事件发生的认识和理解,特异而又有效的预防手段及治疗目前还很贫乏。在胰腺胰腺炎中转录因子NF-kB被激活,促进多种促炎基因的转录。活化的NF-kB诱导多种炎症和凋亡反应的基因转录。NF-kB炎症靶基因包括细胞因子,趋化因子,免疫受体和粘附分子。NF-kB凋亡相关靶基因包括一些抗凋亡分子家族,例如BCL-X,cIAPs。在一些更复杂的系统中,NF-kB发挥促进凋亡的作用,NF-kB活性也能通过上调抑制IkB-a诱导自身负反馈。细胞内NF-kB是复杂的同时又处于一种平衡状态。 文献报道关于胰腺炎机制存在很多争议,大多数研究发现NF-kB是胰腺炎发生中的关键因素,药物抑制NF-kB活性可以改善胰腺炎的疾病进展,然而没有一种抑制剂能够绝对特异利用,这些结论尚不能作为最终定论。另有研究显示在雨蛙素诱导的胰腺炎中,药物抑制NF-kB延长并加重急性胰腺炎,同时有人报道IKK转基因没有诱导胰腺损伤,从这些研究提示NF-kB主要功能不是促进胰腺炎而是一个保护因素,这些相互矛盾结果显示,NF-kB在胰腺炎发生中存在很大的争议。 研究目标 1.建立和利用胰腺特异性NF-kB转基因和基因敲出小鼠,构建胰腺炎模型,模拟疾病过程。 2.观察胰腺炎发生过程中,NF-kB基因鼠的表型并初步探讨NF-kB调控胰腺炎过程的机制。 3.深入研究NF-kB参与胰腺炎发生过程的信号通路及潜在治疗靶点。 研究方法 围绕上述目标,本研究采用以下研究方法: 1.质粒构建 p65/CreER质粒的构建p65编码全长cDNA利用XhoⅠ/XbaⅠ从pBluescript SK+质粒中切下,连接到Loxp-EGFP-Loxp片段后,克隆到含EcoRⅠ位点的pCAGGS载体,pCAGGS载体含有CMV启动子和一个Chicken beta actin外显子。用SpeⅠ/HindⅢ双酶切切下CMV-Loxp-EGFP-Loxp-p65序列,原核注射去繁殖p65F/F小鼠 2.动物模型的建立 2.1p65/CreER胰腺腺泡特异性转基因小鼠胰腺炎模型的建立 2.2p65/IKK/CreER胰腺腺泡特异性转基因小鼠胰腺炎模型的建立 2.3IKK-KO胰腺腺泡特异性小鼠胰腺炎模型的建立雨蛙素50ug/kg腹腔注射或左旋精氨酸4g/kg腹腔注射构建小鼠急性胰腺炎模型 3.免疫组化 经漂洗,封闭,一抗和二抗孵育后检测pSTAT3、pERK、F4/80、Caspase3、CD45、Ki-67、p65等因子在胰腺组织中的表达。 4. RT-PCR 通过RNA提取、逆转录和RT-PCR的方法对胰腺组织,IL-1b、TGF-b、Fibronectin、a-SMA、IL-6、TNF-a、RPS6等的mRNA表达水平进行检测。 5. EMSA 将NF-kB探针与细胞核蛋白混合,用抗体标记后进行凝胶电泳,观察探针与蛋白的结合能力。 6. Western Blot 经过提取蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、曝光等步骤观察a-SMA、Amylase、pSTAT3、BCL2、LC3、Beclin1、ATG7、ATG12、GAPDH等因子的蛋白表达。 7.统计学分析 所有数据均采用x±s表示,计量资料分析采用t检验;计数资料分析采用χ2检验,小样本资料采用Fisher's Exact Test。P0.05具有统计学意义。 研究结果 1.胰腺腺泡细胞p65转基因没有明显代偿性改变及表型诱导剂他莫西芬诱导后,和对照组比较病理没有明显改变。EMSA结果显示,NF-kB活性没有增加 2.p65转基因增加雨蛙素诱导NF-kB活性及加重急性胰腺炎程度,长期大剂量雨蛙素注射,诱导慢性胰腺炎的发生 通过EMSA发现,对照组、p65/CreER组NF-kB活性没有增加,对照雨蛙素组和p65/CreER雨蛙素组NF-kB活性均增加,p65/CreER组更为显著。雨蛙素急性胰腺炎模型中,p65/CreER胰腺炎更严重,血清淀粉酶水平更高,水肿更明显。长期雨蛙素刺激,p65/CreER组腺泡萎缩,炎细胞浸润和纤维化,提示慢性胰腺炎发生 3.IKK2转基因自发诱导胰腺炎 给予诱导剂他莫西芬,IKK2转基因鼠发生p65核定位改变,表达从胞浆至核内。给予诱导剂7天,IKK2转基因数有自发胰腺炎,腺泡细胞损伤,水肿,炎细胞浸润,诱导后90天观察,小鼠体重减轻,病理有慢性胰腺炎的改变 4.p65/IKK2转基因诱导重症胰腺炎及自噬增加 给予诱导剂P65/IKK2后,小鼠腺泡损伤严重,细胞因子纤维化因子mRNA水平表达明显升高。蛋白质水平检测自噬相关因子,表达升高。提示通过增加活化NF-kB水平使得自噬水平升高 5.抑制自噬,雨蛙素诱导p65/IKK2转基因小鼠胰腺炎加重 给予自噬抑制剂氯喹,病理显示p65/IKK2转基因小鼠胰腺损伤更明显。a-SMA蛋白水平升高,提示激活星状细胞。Amylase蛋白水平降低,提示胰腺腺泡损伤更为剧烈。 6.IKK2-KO在不同胰腺炎模型中胰腺炎加重 IKK2-KO在雨蛙素诱导急性胰腺炎模型、左旋精氨酸诱导急性胰腺炎模型中病理提示均比对照组胰腺炎更重。左旋精氨酸模型诱导模型类似坏死性胰腺炎 7pSTAT3介导BCL-2参与IKK2-KO诱导急性胰腺炎 雨蛙素1H后,Western-blot检测pSTAT3明显升高,免疫荧光检测p65核定位发现:IKK2-KO入核少,大多数在胞浆表达,对照组表达在核内。检测STAT3下游靶基因BCL-2发现,蛋白水平升高。 8.抑制STAT3对于IKK2-KO小鼠急性胰腺炎的影响使用STAT3抑制剂S3I-201组,病理显示均能明显降低急性胰腺炎严重程度,炎细胞浸润减少,水肿减轻。 结论 1.NF-kB在胰腺炎发生过程中发挥重要作用 2.NF-kB激活能加重急性胰腺炎、诱导慢性胰腺炎。抑制NF-kB活性将有利于胰腺炎预防和治疗。 3.自噬在NF-kB激活状态下起保护作用 4. pSTAT3参与激活Bcl-2机制使得IKK2-KO小鼠胰腺炎加重,抑制NF-kB活性的同时抑制STAT3,可能对于治疗胰腺炎有帮助


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