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模拟干细胞Niche同步实现表皮干细胞扩增与皮肤替代物构建的实验研究

纪世召  
【摘要】:研究背景 表皮干细胞主要位于皮肤基底层和毛囊隆突部,由于细胞数量相对较少且增殖慢,因此如何快速扩增表皮干细胞一直是皮肤组织工程研究中的热点和难点。目前主要利用表皮干细胞对基底膜的显著黏附特性进行分离、纯化,采用二维平面的培养方式进行培养,同时为了保证干细胞的单一及清除分化增殖能力不强的细胞,传代扩增时需要首先将基底膜的主要成份之一Ⅳ型胶原平铺于培养皿,但仍然难以避免多次传代培养后细胞克隆形成率明显下降、细胞逐渐分化、增殖活性降低等缺点,而且由于表皮干细胞固有的慢增殖特性,传统的二维培养方式难以在较短时间内扩增足量的细胞。 微载体培养是一种大规模扩增贴壁依赖型细胞的技术,提供了细胞单层培养时不具备的三维立体空间,模拟了细胞在体内的生长环境,不仅可以大量扩增细胞,而且有利于维持细胞表型、防止分化,现已广泛地应用于生物制药领域。最近,有研究者采用微载体培养技术扩增干细胞取得良好效果,如以Cultispher-S、Cytodex、Solohill、Matrigel-coated cellulose等扩增间充质干细胞及胚胎干细胞,不仅在短时间内可大量扩增,而且维持其多向分化潜能。因此我们设想,采用微载体技术为表皮干细胞提供更适于其生长、增殖的三维立体空间。然而,目前研制的微载体多以生物材料人工合成,尽管有研究者采用表面改良或修饰等仿生技术处理,但缺乏基底膜结构,仍难以模拟表皮干细胞生长的体内niche微环境,不利于表皮干细胞的粘附、增殖。 研究表明人羊膜是理想的细胞培养扩增载体,具有天然的人体最厚的基底膜,其基本结构与皮肤、角膜基底膜相似,此外基质中含有丰富的生长因子,如NGF、HGF、KGF、bFGF、TGF-β1、EGF等,可以在体外模拟干细胞生长的niche微环境,因此羊膜被用于角膜缘干细胞、间充质干细胞的扩增和移植。 本研究利用羊膜固有的生物学特性,制备具有完整基底膜结构和生物学活性的三维立体微粒羊膜,以其作为一种天然的新型微载体,结合旋转培养系统进行表皮干细胞的体外培养与扩增,评价其培养、扩增表皮干细胞的效果及维持干细胞特性的作用。在此基础上构建含表皮干细胞的皮肤替代物,并评估其作为皮肤替代物修复全层皮肤缺损的可行性。 研究方法 1.羊膜微载体的制备及特征检测 1.1羊膜获取及微载体制备 经医院伦理委员会批准,产妇知情同意,选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均为阴性的剖腹产妇的胎盘组织,钝性分离绒毛膜,剥离羊膜。 采用反复冻融结合DNA酶消化法去除羊膜细胞,片状羊膜经冷冻裂解技术均质化制备微粒,然后在真空密闭条件下冷冻干燥,通过金属筛网筛选过滤,获得300-600μm的微粒羊膜。 1.2羊膜微载体物理特征及组织结构检测 采用扫描电镜观察mAM的形状及大小,石蜡包埋切片HE染色及表面HE染色观察羊膜细胞的去除情况及组织结构,免疫组化染色和透射电镜观察mAM保留的基底膜结构。 1.3生长因子及DNA含量分析 Western blotting、Elisa测定mAM基质中的生长因子含量:EGF、bFGF、HGF、TGF-β1、KGF,NGF。DNA试剂盒测定DNA含量,Hoechst染色观察mAM表面残存DNA情况。 1.4mAM组织相容性检测 通过mAM浸提液实验观察mAM基质对细胞的毒性,大鼠皮下移植实验评价mAM的组织相容性,Masson三色染色检测羊膜胶原基质降解过程。 2.mAM培养、扩增表皮干细胞并构建皮肤替代物 2.1mAM培养、扩增表皮干细胞 分离培养表皮干细胞,以mAM作为微载体,结合旋转培养系统培养扩增表皮干细胞,定期取材标本以hoechst33342荧光标记,荧光显微镜下观察表皮干细胞黏附增殖情况。 2.2表皮干细胞增殖活性及特性检测 以常规二维培养作为对照,采用CCK-8测定微载体培养、扩增表皮干细胞的增殖活性,免疫组化检测表皮干细胞的表面特征标记:β1整合素、CK19、P63及CK10的表达情况。 2.3构建并扩增含表皮干细胞的皮肤替代物 以mAM作为真皮支架,在三维旋转培养体系下,种植表皮干细胞,构建含表皮干细胞的皮肤替代物,借助“球碰球”传接技术,通过加入新的羊膜微载体扩增皮肤替代物。行组织切片HE染色及电镜扫描观察含表皮干细胞皮肤替代物的形态特征。 2.4皮肤替代物移植全层皮肤缺损创面 以裸鼠全层皮肤缺损创面为动物移植模型,将构建好的含表皮干细胞的皮肤替代物移植创面,观察其修复全层皮肤缺损创面的效果,定期测定创面愈合率,并行组织学检测。 研究结果 1.mAM物理特性及DNA含量 通过物理反复冻融3次,辅助DNase酶消化可完全去除羊膜中的细胞及核酸,利用冷冻裂解技术可制备mAM,其外观白色、半透明状,呈六面体,形状不规则,大小在300-600μm之间,厚度为80-250μm。mAM基质中核酸基本去除干净,去除率达85±4.15%。 2.mAM组织结构及生长因子检测 mAM基底膜结构保存完整,羊膜上皮细胞、成纤维细胞等去除完全,胶原组织连续、排列规则,可见层粘连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白连续分布,贯穿于整个基底膜,同时基质中保留了多种生长因子:NGF、HGF、KGF、bFGF、TGF-β1、EGF。 3.mAM浸提液毒性及组织相容性评价 mAM浸提液细胞培养发现不含任何毒性,而且以其培养细胞增殖速度明显高于对照组。大鼠皮下移植发现mAM组织相容性良好,移植后未见明显急性炎症或排斥反应,14d时显示许多微血管形成,30d时mAM开始降解,90d时基本降解完全,与周围组织融合,胶原纤维排列整齐。 4.mAM培养、扩增表皮干细胞 表皮干细胞种植后半小时即可见粘附于mAM表面,呈立体三维生长。培养第3天开始mAM培养扩增细胞相对增殖活性即明显高于培养皿,培养7、14天时,相对增殖活性分别为326±28%、535±47%,远高于常规的培养皿培养方法(232±21%,307±32%,P<0.05)。同时干细胞特征检测可见表皮干细胞高表达β1整合素、K19及P63。 5.构建并扩增含表皮干细胞的皮肤替代物 以mAM为真皮支架,表皮干细胞为种子细胞可成功构建含表皮种子细胞的活性皮肤替代物,培养14d表皮干细胞已形成2-3层。利用“球碰球”传接技术,通过加入新的mAM即可实现快速扩增含表皮干细胞的皮肤替代物。 6.皮肤替代物移植修复全层皮肤缺损创面 移植后2周,可见ESC-mAM组新生表皮形成,而对照组可见残存创面,创面收缩明显;移植后4周可见ESC-mAM、mAM组愈合表皮下微粒充填真皮基质,ESC-mAM组伴有表皮乳突样结构形成,类似正常皮肤,而对照组表皮细胞基底处平整未见乳突样结构形成。 研究结论 1、反复冻融辅助DNA酶消化法可有效去除羊膜细胞成份,结合冷冻裂解可以制备微粒羊膜,其不仅具备一般微载体的特性,而且具有完整的基底膜结构,同时基质中保存了多种生物活性物质。 2、微粒羊膜作为一种新型的微载体,可以为表皮干细胞的体外培养、扩增提供近似体内生理的Niche微环境,可在迅速扩增表皮干细胞的同时,维持干细胞增殖活性,防止其分化。 3、微粒羊膜具备良好的组织相容性,可以作为真皮支架快速构建含表皮干细胞的皮肤替代物,并修复全层皮肤缺损创面,改善创面愈合质量。即mAM可以同步完成表皮干细胞的大量扩增与皮肤替代物的快速构建。 4、通过加入新的羊膜微载体的方式即可以实现含表皮干细胞皮肤替代物的快速扩增,缩短了体外培养时间,改善了皮肤替代物的传统构建模式,提高了皮肤替代物从实验室构建到临床应用的效率,为促进皮肤替代物向临床转化与应用提供新方法和新思路。


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