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ALDH2对缺血性脑卒中的作用研究

郭晋敏  
【摘要】:脑卒中危害极大,目前是人类的第二大死亡原因,且发病率仍呈上升趋势。在我国,每年有280万人新发生脑卒中,140万人死于脑卒中。随着我国人口的老龄化,脑卒中的问题将日益严重,社会和经济将不堪重负。因此,寻找有效地防治措施至关重要。而针对脑卒中危险因素的有效处理,如降压,降脂,抗动脉粥样硬化以及相关的基因、蛋白调控,可有效地防治脑卒中。但令人遗憾的是,这些已知因素,仅占脑卒中危险因素60%,还有接近一半没能有效地发掘。而对于缺血性心脏病,超过90%的危险因素已被确定,并在心血管疾病的治疗中发挥着重要的作用。因此,脑卒中危险因素的发现还有很大的研究空间。利用现有的手段,发现更多危险因素,并针对其采取有效的治疗手段,对于脑卒中的防治更为有利。 我们实验室具备2种高血压动物模型,自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)以及脑卒中倾向的自发性高血压大鼠(stroke prone spontaneously hypertensive rat, SHR-SP),二者的正常血压对照动物为京都种大鼠(Wistar Kyoto rat, WKY)。SHR-SP来源于SHR,都有高血压,但与后者不同的是,SHR-SP到一定年龄即可发生脑卒中。通过基因芯片技术、蛋白质组学双向电泳技术、质谱分析等手段,对SHR-SP和SHR进行比较(以利于去除高血压引起的差别),我们找出了一系列差异蛋白,发现乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase2,ALDH2)等水平显著地下调。因为排除了高血压等因素,这些差异蛋白可能与脑卒中相关。 ALDH2是存在于线粒体的一种酶,参与乙醇的代谢过程,促进毒性中间产物乙醛(乙醇经脱氢酶催化产生)转化为乙酸,从而发挥酒精解毒作用。除了乙醛,ALDH2对于机体内产生的其他有毒醛类,包括4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE),都有明确地解毒作用。 本课题以ALDH2为中心,试图阐明ALDH2防治脑卒中的作用;确定4-HNE与脑卒中的因果关系以及4-HNE预测缺血性脑卒中发生的可行性。提出假说:ALDH2可能通过清除脑缺血过量产生的毒性代谢醛类4-HNE等,发挥神经保护作用;4-HNE可能是一种重要的脑卒中危险因素。根据此假设,我们也进行了相应的实验。具体实验结果如下: 实验一:ALDH2在SHR-SP脑组织中低表达 利用荧光差异二维电泳实验技术平台,比较分析SHR和SHR-SP脑组织差异蛋白的表达。结果有44个差异蛋白点得到串联质谱的鉴定。其中,ALDH2在SHR-SP脑组织中显著低表达。这一结果在随后的免疫印迹(Western Blot, WB)实验得到验证。 实验二:ALDH2对神经元缺氧缺糖损伤的保护作用 在原代培养的神经元上,ALDH2激动剂Aldal(10μM)能减轻缺氧缺糖(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)诱导的神经元凋亡(16.7±0.62%vs.28.9±0.12%invehicle),而抑制剂Cya(1mM)则促进神经元凋亡(45.2±3.26%vs.28.9±0.12%invehicle)。利用慢病毒使ALDH2过表达(约2倍)或基因沉默(约0.16倍)也得到了类似的结果。首先通过感染预实验得到合适的感染复数(MOI值=10),保证转染效率超过90%。过表达ALDH2的神经元对能缺氧损伤的耐受力增强(12.6±0.2%vs.57.8±2.1%),而干扰ALDH2表达后神经元对缺血缺氧损伤易感性增加(62.1±2.4%vs.46.1±0.7%)。 实验三:ALDH2对整体急性脑缺血损伤的保护作用 Sprague-Dawley(SD)大鼠侧脑室给予ALDH2激动剂Aldal (50μg/5μl), ALDH2活性增加109%,大脑中动脉栓塞(niddle cerebral arterial occlusion, MCAO)24h半脑梗死面积降低40%;而侧脑室给予ALDH2阻断剂Cya(1mg/5μl)后,ALDH2活性降低60%,脑缺血梗死面积增大30%。 我们将表达ALDH2的慢病毒载体(LV-ALDH2)、对照病毒(LV-GFP)及RNA干扰ALDH2的慢病毒载体(sh-ALDH2)、对照病毒(sh-Scramble)利用立体定位仪注射到SD大鼠的脑组织中,3周后,WB验证ALDH2在脑局部的表达情况,行MCAO手术。与相应对照病毒组相比,LV-ALDH2使ALDH2在脑局部表达增加约100%,sh-ALDH2使ALDH2脑局部表达降低约60%。过表达ALDH2使MCAO术后24h半脑梗死面积从38%降至12%,神经行为学损伤也得到缓解;而干扰ALDH2表达则得到相反的结果,脑缺血梗死面积从37%增至49%,神经行为学损伤也加重。 实验四:4-HNE在SHR-SP中高表达并与其寿命呈负相关 比较WKY,SHR以及SHR-SP血清4-HNE含量,3月龄时,SHR与WKY血清4-HNE水平无差别,SHR-SP显著升高;6月龄时,SHR血清4-HNE含量较WKY略有增加,SHR-SP血清4-HNE高表达,是WKY、SHR血清含量的3倍以上。利用WB方法测定3组动物6月龄时脑皮层4-HNE,SHR-SP脑组织含量显著高表达。另外,我们检测27只8月龄SHR-SP血中4-HNE水平,同时记录其死亡时间,发现4-HNE与SHR-SP生存时间呈显著的负相关(r=-0.602,P0.001)。 实验五:4-HNE在脑卒中患者以及脑卒中倾向人群高表达 我们进一步通过两种临床实验观察4-HNE与脑卒中的关系。一种是病例对照研究。以年龄、性别等相匹配人群为对照,测定缺血性脑卒中病人在发病0-3d,7-14d以及3-6月不同时间段4-HNE变化情况,发现各期脑卒中患者4-HNE含量均高于对照人群,其中7-14d的4-HNE水平最高(15.5±2.8,18.2±3.3,14.2±1.7vs.9.1±1.9mg/ml in control,P0.001)。另一种是队列研究。与北京朝阳医院蔡军副教授合作,利用他们2004年保存的1242名社区人群血浆样品,以及完整的随访材料(截止到2011)开展本试验。8年的随访中,共有21例在随访中发生脑卒中。我们从其余未发生卒中人群中随机取45例作为对照组。未发生卒中与发生卒中人群基本信息比较发现:饮酒率、谷丙转氨酶(ALT)与血肌酐有显著差异,但ALT与血肌酐均在正常范围内,其余信息均无差异。并且,21名发生卒中人群的4-HNE含量明显高于未发生卒中人群(12.1±1.6vs.9.6±1.6mg/ml,P=0.0007)。 实验六:4-HNE加重脑缺血的作用被ALDH2取消 在脑缺血情况下,醛4-HNE显著增加,并且4-HNE能进一步加重急性脑缺血损伤。SD大鼠侧脑室注射4-HNE,显著地加重MCAO导致的急性脑缺血损伤(31.25[μg/5μl,51.2±4.5%vs.32.8±2.7%in vehicle,P0.01);4-HNE促进OGD诱导的神经元凋亡(0.1mM,44.6±7.2%vs.29.8±4.8%in vehicle,P0.01)。我们证实:OGD可以诱导神经元内4-HNE表达增加,而这一作用完全被ALDH2激动剂Aldal所取消,而被ALDH2抑制剂Cya所促进,提示:ALDH2可以有效地代谢脑内4-HNE。LV-GFP微注射大鼠脑皮层组织,侧脑室给予4-HNE (31.25μg/5μl)后进行MCAO,术后24h血清4-HNE含量增加62%,脑缺血梗死面积增加45.9%。而在LV-ALDH2大鼠上,侧脑室给予4-HNE后4-HNE含量及脑缺血损伤均没有明显变化(567±17.1vs.417±8.1ng/ml;13.2±6.9%vs.12.3±6.7%)。 实验七:6%酒精对脑缺血损伤以及ALDH2的影响 我们发现:6%酒精(ethanol,EtOH)能减轻急性脑缺血梗死面积(25.1±3.4%vs35.2±2.3%),缓解神经行为学损伤。6%酒精同样能延缓SHR-SP脑卒中的发生(Logrank8.9984,P=0.0027)。与对照组相比,生存时间增加了约33%。酒精6%并不增加脑或者肝ALDH2的表达,但能显著增加脑皮层ALDH2活力(138±38.9%vs.100±17.2%)。利用二维电泳技术,我们发现:6%酒精诱导ALDH2等电点分布发生改变,可能是由于ALDH2发生磷酸化所引起,但仍需进一步实验证实。在正常SD大鼠上,6%酒精并不影响血清4-HNE的水平(159±54.0vs.170±45.8ng/ml)。而对于MCAO大鼠,适量酒精显著降低了术后24h血清4-HNE的含量(464±29.3vs.608±53.1ng/ml)以及缺血脑组织4-HNE的表达。 实验八:ALDH2介导6%酒精对脑缺血损伤的保护作用 以上实验发现6%酒精能增加ALDH2的活力,因此,我们下一步验证ALDH2是否参与了酒精对脑缺血的保护作用。侧脑室给予ALDH2抑制剂Cya (1mg/5μl)后,6%酒精的保护作用被取消。对于脑局部微注射sh-ALDH2的大鼠,6%酒精并没有减轻急性脑缺血损伤,也没有减轻MCAO术后4-HNE的增加,sh-ALDH2组及sh-ALDH2+EtOH组均呈现高水平的4-HNE,即基因沉默ALDH2后,取消了6%酒精对脑缺血的保护作用以及对4-HNE降低的作用。 实验九:酒精的保护作用依赖于PKCε 在神经元上,30mM酒精作用4h能促进神经元PKCε的磷酸化(增加68%),也能促进神经元内ALDH2与PKCε的相互结合。PKC有很多亚型,酒精对PKCa则无此作用。在神经元或脑局部,转染携带PKCε的慢病毒(LV-PKCδ)增加PKCε的表达,以及基因沉默PKCε的慢病毒(sh-PKCε)来干扰PKCε的表达,发现:神经元过表达PKCε可以减轻OGD诱导的缺氧缺糖损伤(12.5±0.1%vs.38.2±0.1%);而干扰神经元PKCε的表达,则作用相反(55.6±2.9%vs.46.3±0.7%)。脑局部过表达PKCε也可以减轻急性脑缺血损伤(26.2±4.1%vs.34.8±3.9%in LV-GFP),且此保护作用被sh-ALDH2所取消(49.8±14.7%in LV-PKCε+sh-ALDH2vs.34.8±4.5%in LV-GFP+sh-ALDH2)。脑局部基因沉默PKCε后,大鼠脑内ALDH2活力减少68%,而且完全取消了6%酒精对ALDH2的激活作用。脑局部微注射sh-PKCε的大鼠,同样取消了6%酒精对脑缺血的保护作用(42.0±2.7%vs.38.8±6.9%without ethanol)以及减少4-HNE的作用(1054.1±107.9vs.952.3±71.6ng/ml without ethanol)。 结论: 1.增加ALDH2含量或活力,可减轻缺血性脑损伤,其机制可能通过清除脑内过量产生的毒性代谢醛类4-HNE等,发挥神经保护作用。 2.4-HNE可能是一种新的脑卒中危险因子。 3. PKCε可调节ALDH2活性,其神经保护作用通过ALDH2发挥。 4.适度饮酒通过激活PKCε-ALDH2通路,减轻缺血性脑损伤。


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