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槐定碱对大鼠慢性心力衰竭干预作用的研究

路红  
【摘要】:目的: 槐定碱(Sophoridine)是从豆科槐属植物苦豆子SophoraalopecuroidesL中分离的单体生物碱,近年来发现槐定碱在抗心律失常和增强心肌收缩力方面有重要的药理作用和应用前景,本实验以慢性心衰大鼠作为模型,以槐定碱作为干预剂,从细胞、分子和超微结构水平,对慢性心衰大鼠心肌细胞异常钙循环和超微结构进行研究,为槐定碱的临床应用提供基础性实验资料。 方法: (1)实验分组:将SD大鼠随机分为5组,每组10只,分别为假手术组,心力衰竭组,槐定碱低、中、高(5、10、20mg/kg)剂量组;(2)心衰模型制备:心力衰竭组和药物干预组大鼠均行冠状动脉左前降支永久性结扎,假手术组除只穿线不结扎冠脉外,其余步骤相同。4周后检测各组大鼠心衰模型相关指标;(3)心肌细胞L-型钙电流(ICa·L)、胞浆内钙瞬变和肌浆网内钙容量的测定:酶解法分离心肌细胞,Fluo-3/AM负载心肌细胞,采用全细胞膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜联机技术同步记录各组大鼠心肌细胞ICa·L和胞浆内钙瞬变;利用Fluo-5N/AM负载心肌细胞,直接记录肌浆网内钙容量;(4)钙调控相关蛋白分子生物学检测:采用Western-blot方法测定钙调控相关蛋白SERCA2a、PLB、NCX表达水平,并进行蛋白表达半定量分析;(5)超微结构观察:各组大鼠心肌按照常规透射电镜样品制备技术制样后,透射电镜下观察,拍照记录超微结构。(6)统计学处理:采用SPSS11.0统计软件包进行分析。全部计量资料数值均以均数±标准差(x±s)表示。各组之间差异显著性判别先进行方差分析(ANOVA),如差异显著,则进一步用LSD法进行两两比较。P0.05认为差异有统计学意义。 结果: (1)槐定碱对慢性心衰大鼠心重指数及心功能的影响:与假手术组相比,心力衰竭组心重指数(HW/BW)和左心室舒张末压(LVEDP)升高,左室内压最大上升速率(+dp/dt_(max))和左室内压最大下降速率(-dp/dt_(max))降低(P0.01);与心力衰竭组相比,槐定碱中、高剂量组的HW/BW和LVEDP降低(P0.01),+dp/dtmax和-dp/dtmax升高(P0.01),槐定碱低剂量组的+dp/dt_(max)明显升高(P0.01),-dp/dtmax变化不明显(P0.05)。(2)槐定碱对心肌细胞L-型钙电流(ICa·L)的影响:心力衰竭组大鼠的I_(Ca·L)低于假手术组;槐定碱低剂量组、中剂量和高剂量组心肌细胞的I_(Ca·L)较心力衰竭组均明显增大。(3)槐定碱对各组大鼠心肌细胞钙诱导钙释放(CICR)的影响:CICR过程中的钙火花发生率心力衰竭组明显低于假手术组,且钙瞬变峰值(ΔF/F0)心力衰竭组(17.05±1.25,n=12个细胞)明显低于假手术组(49.64±2.68,n=12个细胞,P0.01);槐定碱低剂量组的钙火花发生率较心力衰竭组增加,钙瞬变峰值(18.96±1.01,n=12个细胞)高于心力衰竭组(17.05±1.25,n=12个细胞,P0.05);槐定碱中、高剂量组的钙火花发生率较心力衰竭组明显增加,且钙瞬变峰值中剂量(45.79±2.52,n=12个细胞)和高剂量组(47.21±2.07,n=12个细胞)明显高于心力衰竭组(17.05±1.25,n=12个细胞,P0.01)。(4)槐定碱对各组大鼠心肌细胞肌浆网(SR)钙容量的影响:心力衰竭组大鼠心肌细胞Fluo-5N/AM染色后荧光强度显著低于假手术组心肌细胞Fluo-5N/AM染色后的荧光强度;且荧光强度变化的平均值(ΔF/F0)心力衰竭组(21.4±2.54,n=12个细胞)亦明显低于假手术组(56.4±3.01,n=12个细胞,P0.01);槐定碱低剂量组大鼠心肌细胞Fluo-5N/AM染色后荧光强度比心力衰竭组增大,荧光强度变化的平均值(ΔF/F0)(31.1±2.93,n=12个细胞)高于心力衰竭组(21.4±2.54,n=12个细胞,P0.01);槐定碱中、高剂量组心肌细胞Fluo-5N/AM染色后的荧光强度较心力衰竭组均明显增大,荧光强度变化的平均值(ΔF/F0)中剂量组(53.8±3.38,n=12个细胞)和高剂量组(56.2±3.28,n=12个细胞)无明显差异,两者均明显高于心力衰竭组(21.4±2.54,n=12个细胞,P0.01)。(5)钙调控相关蛋白分子生物学结果显示:①与假手术组相比,心衰组SERCA2a的表达量下降;半定量分析结果显示:心衰组SERCA2a/GAPDH(0.041±0.003,n=6)显著低于假手术组(0.25±0.02,n=6,P0.01);与心衰组相比,槐定碱中剂量组(0.082±0.006,n=6)和高剂量组(0.074±0.005,n=6)明显高于心衰组(0.041±0.003,n=6,P0.01);槐定碱低剂量组(0.042±0.002,n=6)与心衰组相比无明显差异。②与假手术组相比,心衰组PLB的表达量无明显区别;半定量分析结果显示:心衰组PLB/GAPDH(0.63±0.03,n=6)与假手术组(0.66±0.03,n=6)相比无显著差异;槐定碱低剂量组PLB/GAPDH(0.58±0.05,n=6)、中剂量组(0.63±0.02,n=6)和高剂量组(0.63±0.06,n=6)与心衰组相比均无明显差异。③与假手术组相比,心衰组NCX的表达量无明显区别;半定量分析显示:心衰组NCX/GAPDH(0.099±0.004,n=6)与假手术组(0.099±0.005,n=6)相比无显著差异;与心衰组相比,槐定碱低剂量组(0.083±0.003,n=6)明显低于心衰组(0.099±0.004,n=6,P0.01);槐定碱高剂量组(0.116±0.009,n=6)明显高于心衰组(0.099±0.004,n=6,P0.01);槐定碱中剂量组(0.093±0.004,n=6)与心衰组相比无明显差异。④与假手术组相比,心衰组的PLB/SERCA2a(15.13±0.94,n=6)较假手术组(2.66±0.20,n=6)明显增大(P0.01);与心力衰竭组相比,槐定碱低剂量组(13.85±1.88,n=6)减小(P0.05),槐定碱中剂量(7.69±0.48,n=6)和高剂量组(8.57±0.87,n=6)均显著低于心衰组(P0.01)。⑤与假手术组相比,心衰组的NCX/SERCA2a(2.40±0.23,n=6)较假手术组(0.40±0.03,n=6)明显增大(P0.01);与心力衰竭组相比,槐定碱低剂量(1.98±0.12,n=6)、中剂量(1.14±0.04,n=6)和高剂量组(1.58±0.19,n=6)均明显降低(P0.01)。(6)槐定碱对各组大鼠心肌超微结构的影响:假手术组大鼠心肌肌丝排列整齐,线粒体结构完整,嵴结构清楚。心力衰竭组大鼠心肌出现肌丝断裂溶解现象,大多数肌丝排列松散且发生错位,部分线粒体的嵴结构模糊不清,且出现溶解现象。槐定碱低剂量组心肌肌丝溶解有轻微恢复,肌丝排列较整齐,线粒体嵴可分辨。槐定碱中剂量组大鼠心肌肌丝排列整齐,线粒体结构完整,大多数嵴清晰可见。槐定碱高剂量组大鼠心肌未见肌丝溶解,肌丝排列整齐,明暗带分明,线粒体结构基本完整。 结论: 槐定碱能改善慢性心力衰竭大鼠的心功能和心肌细胞的异常钙循环,并能保护心肌超微结构损伤,在一定程度上缓解了心衰,为拓宽槐定碱的临床应用价值提供了理论依据。


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