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TRPC6通道在胶质瘤放疗敏感性中的作用与机制研究

贺华  
【摘要】:脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,约占所有颅内肿瘤的45%。其中WHO分类的恶性胶质母细胞瘤(GBM)约占所有胶质瘤的50%。 由于GBM的高度侵袭性,现有的手术很难达到解剖意义上的全切除,因此常于术后辅以放化疗,以提高胶质瘤患者的综合治疗疗效。尽管如此,目前GBM的中位生存时间只有12个月左右。当前除了积极探索脑胶质瘤发生发展的分子机理、寻找生物治疗的特异性靶标外,努力提高辅助治疗的疗效也是胶质瘤治疗的研究热点之一。 临床资料显示,放射治疗是脑胶质瘤术后辅助治疗的重要措施,但总体疗效不尽人意,而且治疗效果存在极大的个体差异,探索脑胶质瘤对放疗的抵抗机理和增加胶质瘤对放射治疗的敏感性是提高放射治疗疗效的关键。 瞬间受体电位通道C亚家族(TRP-canonical,TRPC)是钙离子通道TRP家族的主要成员之一,前期工作中,我们课题组发现阻断TRPC6通道可导致人胃癌细胞和食道癌G2/M期的阻滞和肿瘤细胞生长的抑制。这些结果表明TRPC6通道在调控肿瘤细胞的细胞周期中具有重要作用,而肿瘤细胞对放射治疗的敏感性与细胞周期密切相关,这给我们提出了TRPC6是否参与脑胶质瘤的病理进展过程以及是否影响胶质瘤细胞对放射治疗的敏感性等问题。 本课题拟在前期工作的基础上,探讨胶质瘤不同病理级别和不同预后与TRPC6之间的相关性,探索TRPC6在脑胶质瘤对放射治疗敏感性中的作用和机理,为提高脑胶质瘤放射治疗疗效提供一定的实验依据。 第一部分人脑胶质瘤中TRPC6的表达和临床病理相关性分析的实验研究 目的: 1.研究TRPC6在脑胶质瘤组织中的表达水平及其与胶质瘤病理级别的相关性;2.探讨TRPC6表达水平与胶质瘤患者生存时间的相关性。 方法: 1.利用免疫印迹法、免疫组化法比较91例不同病理级别脑胶质瘤肿瘤组织中同源且位置接近的TRPC6、TRPC3蛋白的表达水平,并根据随访数据(包括年龄、性别、肿瘤病理级别、手术切除情况、术后放疗方案、生存时间等)分析脑胶质母细胞瘤(GBM)患者预后与TRPC6蛋白表达水平之间的关联性;2.通过realtime PCR检测不同病理级别胶质瘤肿瘤组织中TRPC6和TRPC3的表达水平,探讨其与病理级别之间相关性。 结果: 1. TRPC6蛋白表达与胶质瘤病理级别存在相关性,病理级别越高,TRPC6蛋白表达越高,不同病理级别TRPC6的表达水平存在显著性差异(P0.05);2.41例GBM患者不同TRPC6表达水平与相对应的随访结果统计分析显示:TRPC6低表达组平均生存时间521天,中位生存时间541天;TRPC6高表达组平均生存时间268天,中位生存时间251天;TRPC6高表达组生存时间较TRPC6低表达组短,TRPC6蛋白表达高低两组患者的生存期存在显著性差异(P0.05);3.胶质瘤组织中TRPC6蛋白表达高低与Ki67增殖指数、P53突变、EGFR扩增的表达存在正相关性,均存在显著性差异(P0.05)4、TRPC6mRNA的表达水平与胶质瘤病理级别也存在正相关性,不同病理级别TRPC6mRNA的表达水平存在显著性差异(P0.05)。TRPC3mRNA的表达水平与胶质瘤病理级别不存在相关性,不同病理级别TRPC3mRNA的表达水平不存在显著性差异(P>0.05)。 结论: 1. TRPC6在mRNA水平和蛋白水平表达的高低与胶质瘤的病理级别相关,级别越高TRPC6的表达越高;2. TRPC6的高表达与患者预后不良相关;3. TRPC3在mRNA水平和蛋白水平表达的高低与胶质瘤的病理级别无关;4. TRPC6在胶质瘤组织中的表达与Ki67增殖指数、P53突变和EGFR扩增呈正相关,提示TRPC6可能参与胶质瘤的增殖、凋亡和血管生成等病理机理。 第二部分TRPC6对胶质瘤放疗的影响及其机制的研究 目的: 研究TRPC6在不同胶质细胞株和原代恶性胶质瘤细胞以及荷瘤小鼠中对放疗的影响,并探讨其相关机制。 方法: 1.采用放射线照射和克隆形成实验比较3株不同TRPC6蛋白表达量的胶质瘤细胞系及7例原代培养GBM细胞对放疗的敏感性,以探究TRPC6蛋白对胶质瘤放疗的影响;2.在原位GBM裸鼠模型中定向注射包装显性负突变体TRPC6(DNC6)或GFP的腺病毒载体后观测动物生存期及肿瘤大小变化,以探究阻断TRPC6通道是否对放疗具有增敏作用;3.分析临床胶质瘤患者放疗效果和TRPC6蛋白在GBM细胞中表达水平之间的关联性,以证实实验中得出的TRPC6蛋白对胶质瘤放疗的影响是否具有临床意义;4.采用生物信息学分析方法,对DNC6阻断TRPC6通道后胶质瘤细胞内基因表达谱的变化进行分析,探讨TRPC6通道对下游信号通路的影响;5.采用Realtime-PCR检测胶质瘤细胞系、病例标本中TRPC6mRNA和放疗相关基因mRNA的表达量,并分析其相关性;6.此外,还采用克隆形成实验检测TRPC6蛋白与VM26胶质瘤化疗敏感性的相关性。 结果:1.细胞系、原代细胞和动物实验显示:与TRPC6蛋白表达低的胶质瘤细胞相比,TRPC6蛋白表达量高的胶质瘤细胞对放疗的敏感性低;阻断TRPC6通道能提高胶质瘤细胞对放疗的敏感性,并显著延长原位胶质瘤模型中实验动物的生存期(P0.05);2.对接受标准放疗的29例GBM患者不同TRPC6表达水平与相对应的随访结果统计分析显示:TRPC6低表达组平均生存时间545天,中位生存时间541天;TRPC6高表达组平均生存时间306天,中位生存时间289天;TRPC6高表达组生存时间较TRPC6低表达组短,结果具有统计学意义(P0.05);3.通过对放疗相关信号通路的生物信息学分析,明确了TRPC6在这些通路中进行调控的下游基因的差异,体外实验敲减TRPC6可明显影响下游ATM-CHEK2-P53的表达,Realtime-PCR验证TRPC6mRNA和放疗相关基因mRNA表达量具有相关性,提示TRPC6可能主要通过ATM-CHEK2-P53降低放疗敏感性;4. VM26化疗敏感性与TRPC6蛋白表达量无明显相关性。 结论: 1. TRPC6可能是胶质瘤患者放疗敏感性的指征蛋白,可能通过调节胶质瘤细胞对放疗的敏感性而影响胶质瘤患者的生存期。这类离子通道有可能成为新的治疗胶质瘤的分子靶点;2.胶质瘤中TRPC6可能通过对ATM-CHEK2-P53的调控来降低胶质瘤对放疗的敏感性。


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