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应用RNA干扰技术降低人胚胎心脏袓细胞免疫原性的实验研究

蒋尔鹏  
【摘要】:干细胞移植、组织工程等再生医学技术的临床应用,干细胞是基本要素和必备条件。异体来源的干细胞,伦理、排斥、安全等问题,限制了临床应用;自体来源的干细胞,难以进入产业化生产,制约临床广泛使用,不是再生医学理想之路。核转移(克隆)、诱导性干细胞(iPS)技术,是目前解决该难题的理想方案,但前者在人类尚未成功,后者遇到免疫排斥和安全问题等技术难关。基于免疫排斥反应是由细胞膜上免疫原性分子所决定的基本认识,本课题拟以人胚胎心脏祖细胞为胚胎源性干/祖细胞的代表,首先进行该细胞在未分化及加入IFN-γ、TNF-α模拟体内微环境的情况下,组织相容性抗原(移植抗原)表达情况的检测,确定胚胎源性干/祖细胞移植体内有无免疫原性;其次,利用基因芯片技术筛选与免疫原性密切相关的基因;最后,利用RNA干扰技术阻断所选基因,观测其降低免疫原性的可行性,旨在探讨胚胎源性干/祖细胞临床应用的可能性。 第一部分HECPCs免疫原性及相关基因芯片检测 目的:研究人胚胎心脏祖细胞(Human Embryo-derived Cardiac Progenitor Cells,HECPCs)免疫原性相关分子的表达,并通过基因芯片技术筛选出与HECPCs移植排斥反应关系密切的基因。 材料和方法:1.取4-6周胚龄的人工流产胚胎,体外分离、培养HECPCs,应用流式细胞术检测HECPCs表面免疫原性分子表达情况,并观察在炎性细胞因子作用下免疫原性分子表达情况的变化;2.使用SBC(H1029)基因芯片检测炎性细胞因子刺激前后免疫相关基因的表达情况,初步筛选出表达明显上调、与免疫原性相关的重要基因,并用RT-PCR进行验证。 结果:1.体外培养的HECPCs状态稳定,与原有细胞系性状一致,流式细胞术检测显示加入IFN-γ、TNF-α后HLA-I类分子表达明显升高,在5天时达到峰值,而HLA-DR类分子在各时间点均未见阳性表达;2.基因芯片结果显示,分别加入IFN-γ、TNF-α后两张芯片均上调的基因有116条、下调基因有122条,上调基因中明确与免疫调控有关的基因为57条,挑选其中4条上调幅度较大的基因进行验证,ASNS、IRF-1和MCP-3三条基因表达上调。 结论:1. HECPCs作为再生医学中的种子细胞依然存在免疫原性问题;2.ASNS、IRF-1和MCP-3等基因可能与HECPCs免疫原性密切相关。 第二部分siRNA干扰IRF-1基因及其对HECPCs免疫原性的影响 目的:通过构建以IRF-1为靶点的RNA干扰慢病毒载体,降低HECPCs的IRF-1表达水平,从而获得IRF-1低表达细胞模型,并利单向混合淋巴细胞反应实验来检测其免疫原性的变化。 材料和方法:1.以基因芯片初步筛选出的免疫原性相关基因干扰素调节因子(IRF)-1为靶点,构建慢病毒载体;2.应用Realtime-PCR和Western blot筛选干扰效果最佳的慢病毒载体进行RNA干扰实验;3.利用单向混合淋巴细胞反应实验检测RNA干扰IRF-1对HECPCs免疫原性的影响。 结果:1.针对IRF-1不同序列,构建了Lenti-L1、Lenti-L2和Lenti-L3三个干扰载体;2.慢病毒感染72h后,Realtime-PCR检测Lenti-L1、Lenti-L2和Lenti-L3干扰IRF-1mRNA表达的干扰效率分别为74%、86%、71%,Western blot检测Lenti-L1、Lenti-L2和Lenti-L3干扰IRF-1蛋白表达变化的结果与Realtime-PCR结果一致,Lenti-L2的干扰效果最为明显;单向混合淋巴细胞反应显示,经RNAi处理后HECPCs刺激PBMCs增殖效果明显减弱,提示其免疫原性降低。 结论:1. RNA干扰IRF-1表达可降低HECPCs的免疫原性;2.应用RNA干扰技术进行免疫原性相关基因修饰是降低胚胎源性干/祖细胞免疫原性、减轻移植排斥反应的一种可行方法。


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