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多发性骨髓瘤侧群细胞的研究

刘淑艳  
【摘要】:【目的】鉴定多发性骨髓瘤侧群细胞的存在及生物学特性 【方法】应用流式细胞仪分选七例多发性骨髓瘤患者原代标本及五个MM细胞株的SP细胞。通过细胞周期、免疫表型、集落形成实验、ABCG2mRNA表达量等对SP进行生物学特性的鉴定。并在不同MM治疗药物(A、硼替佐米、As203)作用下,分别使用MTT和集落形成实验检测对骨髓瘤SP增殖、活力和集落形成能力的影响。 【结果】本研究检测了5种MM细胞株,发现SP细胞含量波动于0.8256-1.762%,并在7例MM患者骨髓标本中检测到SP细胞占0.04-2.0%。与MP相比,SP细胞多处于G0/Gl期(95.47%VS49.36%,P0.05),较少的细胞处于S期(3.27%VS40.84%, P0.05)。在免疫表型研究中,观察到SP和MP的CD138、CD38表达并无显著差异,分别为(78.5±8.5)%VS(82.0±4.0)%和(72.3±15.7)%VS(84.3±11.9)%, P0.05。MM细胞株NCI-H929的SP细胞的集落形成数明显高于MP细胞(1392±257VS550±15,P=0.08)。Realtime-PCR显示SP细胞ABCG2的表达明显高于MP细胞(P0.05)。MTT显示在药物相同的作用浓度下,NCI-H929、RPMI8226的细胞生长抑制率随时间的延长逐渐增加。化合物A(4μM、8μM)、硼替佐米(10nM、25nM)及三氧化二砷(1.25μM、2.5μM)分别对NCI-H929及RPMI8226作用24H后,流式细胞仪检测SP细胞的比例变化,发现药物A能够特异性的杀伤SP细胞,而对其他细胞作用不明显,硼替佐米及三氧化二砷非特异性杀伤整体细胞,对SP细胞没有特异性的杀伤作用;而来那度胺(200μM、400μM)作用MM细胞株NCI-H929及RPMI822624H后,能特异性的减少SP细胞比例。分别用化合物A(8μM)和硼替佐米(10nM)作用MM细胞株NCI-H929的SP、MP细胞,发现均能降低SP、MP的集落形成,化合物A分别作用于SP、MP,集落形成数目分别为354±9、287±84,硼替佐米分别作用于SP、MP,集落形成数目分别为80±23、36±41。 【结论】 MM细胞株及原代患者均存在SP细胞,MM细胞株的SP细胞在细胞周期、集落形成能力及ABCG2表达量上与MP均存在显著性差异,而SP和MP在CD38和CD138的表达上无显著性差异。不同浓度的化合物A、硼替佐米、三氧化二砷对MM细胞株NCI-H929、RPMI8226均有抑制作用,并且在一定浓度范围内呈时间和剂量依赖性。药物A能够特异性的杀伤SP细胞,而对其他细胞作用不明显,硼替佐米及三氧化二砷非特异性杀伤整体细胞,对SP细胞没有特异性的杀伤作用。来那度胺对MM细胞株NCI-H929及RPMI8226的SP细胞作用不明显。化合物A和硼替佐米均能降低MM细胞株NCI-H929SP、MP的集落形成。 【目的】筛选骨髓瘤SP细胞相关miRNA表达谱,生物信息学分析预测靶基因及信号通路,进而证明某些特异性的miRNA表达变化可能影响靶基因表达变化的新机制,从而为改善骨髓瘤治疗开拓新的领域。 【方法】miRNA芯片技术筛选MM SP细胞和MP细胞的miRNA表达谱。流式细胞仪分选MM细胞株NCI-H929、RPMI8226和LP-1及3例MM患者的SP细胞及MP细胞,realtime-PCR技术验证芯片结果。生物信息学技术分析MM SP细胞相关通路及靶基因,Wertern blotting检测MM SP和MP细胞在MAPKs信号传导通路上Erk1/2表达量的区别。 【结果】分别使用两种芯片平台,检测了两对多发性骨髓瘤原代标本及RPMI8226骨髓瘤细胞的SP和MP细胞,存在于骨髓瘤SP细胞相关特异miRNA表达谱,包括10个miRNAs在MM的SP细胞中表达显著上调,33个miRNAs在MM的SP细胞中表达显著下调;而后采用real-time PCR技术细胞验证芯片结果(miR-144,miR-451,miR-150),发现同芯片结果相同,SP于MP对比,miR-144和miR-451显著上调,miR-150显著下调。经过生物信息学分析,具有统计学意义的有30个通路(P0.01)。结合文献报道,其中与肿瘤干细胞及MM发病相关的通路包括:Pathways in cancer, Focal adhesion, Endocytosis, MAPK signalingpathway, ErbB signaling pathway, Wnt signaling pathway, mTOR signaling pathway,Ubiquitin mediated proteolysis, TGF-beta signaling pathway。Western blotting技术发现发现SP的p-Erk1/2、p-S6、p-S6K1、p-Src表达量明显下调, TSC1表达无明显变化。免疫荧光技术证实了SP的p-S6的表达量明显下调。siRNA miR451对药物三氧化二砷、硼替佐米及来那度胺起着增敏的作用。 【结论】发现了SP细胞较MP细胞明显上调及明显下调的miRNA,发现了9个明显影响MM SP细胞的通路,其中发现SP的p-Erk1/2、p-S6、p-S6K1表达量明显下调。siRNAmiR451对药物三氧化二砷、硼替佐米及来那度胺起着增敏的作用。


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