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血管成形术后再狭窄及心肌缺血应用hVEGF基因治疗的实验研究

陈少萍  
【摘要】: 冠心病是严重危害人类健康的主要心血管疾病之一,近二、三十年来,随着冠状动脉造影、冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronaryangioplasty,PTCA)和冠状动脉—主动脉旁路移植术(coronary aorta bypassgraft,CABG)等新技术的开展,大多数冠心病患者得到了积极的诊治,但冠心病PTCA晚期再狭窄发生率在30%—50%,CABG移植血管的通畅率亦随术后时间延长而递减,心肌缺血仍是难以解决的问题。能否寻找一种新的治疗方法以防止血管成形术(PTA)后再狭窄,并可促进缺血心肌“分子搭桥”?本研究通过一种重要的促血管生长因子—血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)的基因治疗,观察其对血管成形术(percutaneoustransluminal angioplasty,PTA)后再狭窄的防治作用,以及在缺血心肌侧枝循环建立中的作用,寻找冠心病治疗的新途径。 本实验分为三部分工作,现概述如下: (一)hVEGF_165真核表达载体的构建及表达产物的活性检测。 将已获得的hVEGF_165cDNA克隆到pcDNA_3构建真核表达载体,通过酶切鉴定和DNA测序挑选正向插入的pcDNA_3/hVEGF_165,脂质体介导转染中国仓鼠卵巢细胞Kl亚株(CHO—K_1),经过G-418抗性筛选,挑选出转染阳性细胞克隆,G-418维持培养,提取细胞总RNA,以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照进行Northern Blot分析,培养液上清行Western Blot分析,心肌血管内皮细胞(myocardial endothelial cell,MEC)原代培养加入pcDNA_3/hVEGF_165阳性细胞培养液,采用[~3H]-TdR掺入法检测表达蛋白的活性。结果:1.BamHl酶切鉴定:酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示hVEGF_165cDNA片段大小约600bp。2.测序鉴定:经DNA测序,该cDNA在起始密码(ATG)后第33位碱基发生了T-C突变,但突变前后密码子编码的是同一个氨基酸Leu,属无义突变,其余氨基酸序列与国外报道的完全一致。3.Northern Blot分析:~32P标记hVEGF_165探针的Northern Blot结果显示,实验组(pcDNA_3/hVEGF_165组)在18S和28S之间出现一条约1000base的特异性条带,而对照组(pcDNA_3组)无任何阳性信号出现。4.Western Blot分析:hVEGF_165抗体的Western Blot结果显示,实验组细胞培养液样品出现明显的染色条带,而对照组则无明显条带。5.重组hVEGF_165的活 绍二军医大学 地士学位论义 性检测:们—TdR掺入法检测发现,当加入 PCDNA/ hVEGF;。。转染阳性细胞培养 上清浓缩液0.78八2.5UI时,实验组MEC的掺入率明显高于对照组,其中加入 6.25ul培养液的刺激活性最高,为对照组的198.8%,说明获得的表达蛋白比活 性较高。结论:PCDNA。是较理想的真核表达载体,在绝大部分哺乳动物细胞能 够表达,其表达具有拷贝数高和稳定性好的特点,本实验将hVBG、沪ONA构建 到PCDNA。中获得成功。同时,通过对PCDNA。/hVEGF;。。在哺乳动物细胞中的转 录和表达的检测,证实其能转染真核细胞,获得的表达蛋白比活性较高,提示 本载体可作为基因治疗药物用于哺乳动物的实验研究。 (二)hyEG;。对颈总动脉球囊损伤后血管内皮细胞的修复和再狭窄的防治作 用 将 16只新西兰大白兔随机分为治疗和对照两组,每组又依观察时间分为 ZW 亚组和 44亚组,治疗组予 500ug pcDNA。/hVEGF;。。质粒治疗,对照组予等量 ncDNA。 质粒治疗。在兔颈总动脉实施PTA后即刻,治疗组和对照组分别经扩张导管在 损伤的局部动脉腔内给药,给药处的两端用动脉夹阻断颈总、颈内动脉血流, 结扎颈外动脉;’30分钟后去除动脉夹,恢复血流。给药后ZW、4W行颈总动脉 血管造影,观察 PTA后血管再狭窄情况,而后取 Icm损伤的动脉段置于 10%中 性福尔马林液内固定,常规石蜡包埋,制成4urn厚连续切片,分别做HE、P八B 和Vlll相关抗原染色,以观察内皮细胞的修复速度,管腔狭窄程度和新生内膜 增殖情况,另取k 动脉段液氮保存做Northern Blot分析。结果:1.颈总动 脉血管造影所见:给药后第ZW、4W,hVEGF;。。治疗组血管直径狭窄均较对照组 明显减轻:治疗组给乙酚胆硷(ACh)和硝酸甘油(NG)后损伤的颈总动脉均 明显扩张,而对照组给ACh后血管收缩,给NG后血管扩张。2.病理染色所见: HE染色横切面显示治疗组 ZW、4W管腔平均狭窄分别为 9.SS%和抢 .09%,而对 照组 ZW、4W管腔平均狭窄分别为 31.72%和 44.05%,治疗组较对照组管腔狭窄 程度明显减轻(P<0.01)。P/VB染色纵切面显示治疗组内膜增生程度(内膜/中 膜,I川)ZW和 4W分别为 0.39和 0.76,而对照组内膜增生程度 ZW和 4W分别 为0.82和l.62,治疗组较对照组内膜增生程度明显减轻(P<0.05)。3.免


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