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脐血干细胞体外程序扩增的实验研究

张霞  
【摘要】:脐血中富含干细胞,近年来已逐渐被广泛应用于临床。为了克服单份脐血 中干细胞数目不足的缺点,各种扩增技术应运而生。但同时发现干细胞在扩增 的同时渐走向分化,而使得其应用受到限制。本实验采用一新的扩增方法即体 外程序扩增。小剂量分次加入脐血单个核细胞,一是合理利用基质层腾出的“龛 位”,二是使后来加入的细胞在前者形成的微环境及持续分泌刺激因子的基础 上生长。在增加单核细胞数量的同时,尽量减少干细胞分化。即既保持其“量”, 又保证“质”,以期达到成人移植所需的MNC及CD3~+细胞数目。在乳腺癌、 卵巢癌等各种实体瘤、恶性或非恶性血液病、骨髓瘤、多种遗传免疫缺陷病的 大剂量化疗后的支持治疗中,能够长期造血重建,为这些疾病的治疗提供一种 新的思路或方法。同时,目前临床上应用细胞因子治疗卵巢癌、乳腺癌等各种 实体瘤取得了可喜的成果。但目前临床用药上合理的用药剂量、途径及时机难 以把握。造成细胞因子的巨大浪费,甚至细胞因子在体内浓度过高而造成严重 的毒性作用。受致死剂量或亚致死剂量~(60)C_oγ射线照射的小鼠造血系统的损伤与 临床上卵巢癌、乳腺癌等恶性肿瘤化、放疗所造成的损伤有相类似的病理过程, 为临床研究提供了一良好的动物模型。本实验第二部分用~(60)C_oγ射线照射的小鼠 为模型,首次应用了RSP-CM,深入地探讨了细胞因子对受照小鼠造血系统的防 治作用,发现RSP-CM有促进照射小鼠外周血白细胞及骨髓有核细胞恢复的功 能,且具有量效、时效关系。为卵巢癌等多种恶性肿瘤化疗后的造血支持治疗 提供了另一实验依据。 结果 1.脐血MNC冻存效果 从台盼蓝柜染率看细胞冻存前和冻存后差别显著,但冻后每周差别却不显 著。流式细胞仪测CD34抗原表达冻存前后差别不显著。 2.扩增结果 2.1 脐血MNC的扩增效应 预铺基质层与无基质层相应的两组间比,MNC总数差别显著。且有基质 3 — ——————— 层组细胞生长呈增加趋势,第2~3周为增殖高峰期,无基质层组于第3周始细 胞数明显下降。程序扩增组员在培养前2周MNC计数低于一次扩增组,但随 培养时间延长程序组增殖速度加快,至第3周MNC数与一次扩增组差别不显 著,且第4周仍呈增高趋势。而一次扩增组于培养第3周MNC即开始下降。 2.2 脐血CD34十细胞扩增效应 第1 周内,基质层一次扩增组与基质层程序扩增组,CD34“细胞生长基本 呈同一趋势,第2周基质层程序扩增组增长较快,且培养第3、4周基质层程序 扩增组下降也较基质层一次扩增组慢,一次加入组第3周始CD34抗原不表达。 无基质层一次扩增组与无基质层程序扩增组有同样的变化趋势。说明程序扩增 组在维持CD34“细胞数上优于一次扩增组。 2.3 集落培养结果(CFC): 与新分离的脐血比,培养各周后的集落产率都有所降低,但程序组至培养 第一周仍有集落生成,一定程度上延缓了细胞分化。 3.RSPCM对受不同剂量“qY射线照射的ICR小鼠的疗效 3* 用 RSP-CM和 LP3(M来源的集落刺激因子治疗受不同剂量“C。Y 射线照射的 ICR ,J’鼠。结果:RSP(M能显著提高 7.SGy照射小鼠的活存率。 3.2 RSP(M预防、防治及治疗各组与对照组比差别不显著,保护系数 只有RSP-CM治疗组有效,外周血WBC和BMC计数及祖细胞集落培养也显 示治疗组优于预防组。 3.3 大剂量照射小鼠,RSP(M疗效差。但从保护系数看,各实验组均有 效,且存在量效、时效关系。 结论 1.液氮卜198’C)冻存脐血MNC是一种行之有效的方法,可以长期冻存 而不影响增殖能力。 2.液体培养细胞程序加入法为一种有效的扩增干细胞的方法。一是充分 利用了细胞因子,二是预先加入的细胞补充形


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