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急性肾衰竭与细胞周期调节蛋白cyclin E/CDK2和P27~(kip1)

傅鹏  
【摘要】:目的:急性肾衰竭是临床常见的危重肾脏病之一,急性缺血或因使用氨基糖苷类抗生 素产生急性肾毒性反应是其常见的病因,传统认为其病理特征为急性肾小管坏死,晚近研 究显示,实际上在此过程中肾小管上皮细胞可发生坏死、凋亡和再生,增殖和凋亡的动态 平衡决定了急性肾衰的转归。因此明确这一过程的发病机制对降低本病的病死率、促进患 者肾功能尽早恢复至关重要。非肾细胞的研究已表明,细胞周期调节蛋白调控着细胞的增 殖和凋亡过程,其中cyclin E/CDK2和p27Kip1是G1期向 S期的进展过程中的关键蛋白。本 课题拟研究急性肾衰竭过程中肾小管上皮细胞增殖和凋亡的动态变化以及cyclin E/CDK2和 P27kip1在肾组织细胞中的表达,探讨组织细胞形态改变与细胞周期调节蛋白的可能联系。 方法:本课题分为体内实验和体外实验。前者建立肾脏缺血再灌注的大鼠急性肾衰模 型,分别于第2、7、10和14天后宰杀大鼠,取出肾脏,以常规生化法测定不同时间大鼠 血清肌酐水平,采用增殖细胞核抗原(PCNA)的兔疫组化法观察肾小管上皮细胞增殖情况, 以琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡的DNA片段和以脱氧核苷末端转移酶介导的原位缺口末端 标记(TUNEL)法测定细胞凋亡指数,采用免疫组化法观察cyclin E/CDK2和P27kip1在肾 组织内表达的部位、程度,以 Western Blotting(蛋白印迹)技术检测 cyclin E/CDK2和 P27kip1 蛋白在肾组织内的表达,以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定P27kip1 mRNA在肾 组织内的表达。后者以体外肾小管上皮细胞(LLC-PK1细胞)为实验对象,予以不同浓度 的庆大霉素(0.2~3.2 mg/ml)共同培养24~96h,经常规HE染色观察细胞生长和凋亡的形 态变化,以MTT法测定庆大霉素对细胞增殖的抑制作用,琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡的 DNA片段及流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞周期的变化,以酶法测定细胞培养上清液中 的 NAG含量,以 Western Blotting技术检测 cyclin E/CDK2和 P27kip1蛋白在细胞内的表达, 以 RT-PCR法测定 P27kip1 mRNA在细胞内的表达。 结果: 1.体内实验: 大鼠血清肌酐在缺血再灌注的第2天开始升高,第7天达到高峰,第10天开始降低, 第14天恢复正常。对照组肾组织中细胞增殖指数(PI)为0.7%,缺血再灌注第2、7、10、 14天分别为14.8%、30.9%、23.6%和12.4%;正常对照组和缺血再灌注第2天大鼠肾组织 At级傅士学杉H沦文 中文摘要 DNA琼脂糖凝胶电泳未见到典型的梯形条带,而缺血再蠢注第7、10天大鼠肾组织DNA 电泳则呈现出由 18M00 hP 不同倍数的 DNA 片段组成的近十条阶梯状条 带图谱;IUN’--L分析表明,对照组肾组织切片中细胞凋亡指数(AI)为0.6%,缺血再沼 注第 2、7、10和 14天大鼠肾组织中川分别为 18.7%、35.4%、14.9o和 l.5o.免疫组织 化学结果提示cyclin E和 CDKZ在对照组肾组织中基本不表达,而在肾脏缺血再沼注第 2 天开始表达,且均在第7天表达量最高,此后逐渐下降;表达部位主要在肾小管,少数在 间质,肾小球内基本无表达:而昨7叫‘的表达趋势则与正性蛋白相反,即在缺血再启注前 表达较强,肾组织发生缺血再灌注后表达明显减弱,至缺血再灌注第7天表达最弱,此后 又逐渐增强。Western BlOtting分析表明,cyclin E和CDKZ在正常对照组大鼠肾组织中蛋 白水平较高,肾缺血再灌注第2天开始升高,第7天表达最高,第10天开始降低,但仍高 十 于对照组,第14天降至最低水平。而p27“‘P’在正常对照组肾组织中蛋白水平很高,肾缺血 再灌注的第二天蛋白水平开始降低,第7天水平最低,第川天蛋白表达又回升,至14天 时基本恢复到正常水平。RT-PCR检测表明,正常对照组大鼠肾组织p27“‘P‘的mANA高度 表达,在缺血再灌注的第 2天 InRNA水平开始降低,第 7天水平最低,第 10天开始恢复, 第14天基本恢复到缺血再灌注前的水平。 2.体外实验:


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