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CD40-CD40L共同表达及其信号通路在动脉粥样硬化形成中的实验及临床研究

严金川  
【摘要】:动脉粥样硬化(AS)是严重危害人类健康的常见病,其发病率有逐年增加的 趋势,AS的发生机制是多因素综合作用所诱发的机体应答反应,如脂质代谢、 血凝、炎症反应、细胞因子和血液动力学的影响等等。众多研究表明,体液免 疫和细胞免疫参与了 AS 形成的全过程。而且,越来越多的证据表明,炎症反 应及免疫介导在AS的发生机制和冠心病心血管触发事件发生中起重要作用。AS 斑块不稳定和破裂的因素众多,如斑块本身的结构特征、平滑肌细胞的含量、 巨噬细胞浸润等。但触发斑块破裂的始动因素或关键环节目前尚不清楚。 CD40-CD40L 是一对互补跨膜糖蛋白,分别属于肿瘤坏死因子受体 (TNFR)和 TNFR 超家族成员,在体液免疫和细胞免疫中是一条重要的细胞 信号转导途径。CD40-CD40L 基因突变或表达异常与某些炎症反应,自身免疫 性疾病和免疫缺陷病的发生密切相关。近年来的研究发现,这一条受体-配体参 与了 AS 的发生和发展。CD40L(亦称为 CD154)可激活 AS 斑块中的巨噬细 胞、平滑肌细胞、内皮细胞及 T 淋巴细胞分泌产生在 AS 及其斑块稳定中起关 键作用的成分,如粘附分子(AM)、细胞因子(cytokines)、炎症因子、基质金属 蛋白酶(MMPs)和组织因子(TF)等。动物模型中亦证实应用特异性抗体阻断 CD40-CD40L 的反应,可明显减轻粥样斑块形成。因此,CD40-CD40L 之间相 互作用在 AS 的致病机制中可能是始动因素,并可促发胞内信号转导通路的激 活,逐渐形成恶性循环,最终导致急性冠脉综合征的发生。 本实验中,我们分别应用流式细胞术(FCM)、RT-PCR、荧光显微技术及 Western blotting,从细胞水平、分子水平及蛋白质水平,证实人的脐静脉内皮 细胞和单核细胞表面能共同表达 CD40 和 CD40L。ox-LDL 及细胞因子如 IL-1、 *本课题受国家重点基础研究(973)项目及上海市医学科技发展基金重大课题项目资助。 2 — ——————— IFN-,、TNF能明显刺激内皮细胞和单核细胞上调CD40和CD40L的表达。并 应用免疫组化方法证实在人的主动脉粥样斑块中存在CD40和CD40L高表达, 而在动脉壁的其它部分则不表达。并且我们发现,CD40L主要表达在斑块的肩 部和底部,而 CD40表达比较广泛,斑块中 CD40L表达不如 CD40明显。 CD40L与胞膜CD40受体相互作用后,可引起胞内二酞基甘油-蛋白激酶C (DAG-PKC)及 C4”信号通路的变化。DAG-PKC及 C4”是细胞内重要的信 号转导环节。细胞内游离钙升高在动脉粥样硬化发生、发展过程中有极其重要 的作用。本实验中我们应用外源性人重组CD40L(oD40L喇激HUVEC及MO, 观察rCD40L对细胞内信号转导通路的影响,并观察降脂药物Simvastatin的干 预效果。实验中采用放射酶标记、薄层层析、放射自显影方法测定细胞内DAG 含量变化,细胞内P*C活性及*d“浓度分别采用T.’中.AT P磷酸转移法和FIO. 3/AIn荧光负载,流式细胞术检测。结果显示:mD40L刺激HUVEC及M。产 生 DAG具有双时相性变化,第一个峰值在 15—20秒,另一峰值在 10分钟左右, 并随浓度增加,胞内DAG含量也呈增加趋势。rCD40L刺激H种细胞后,4分 钟时细胞 PKC活性开始升高,14分钟时,PKC活性达峰值,并呈剂量依赖方 式促进细胞内PKC总活性增加,并可引起细胞中PKC活性发生浆膜的转移。 上述信号通路的变化效应,可被am七D40肌b阻断,这就进一步证实,rCD40L 引起的DAGFKC途径的激活是通过CD40而起作用的。胞浆内游离钙的升高 分二个时相,即快速相和持续相。前者是有胞内钙池释放引起,而后者主要由 胞外钙的内流引起。辛伐他汀Gimvastatin)能明显抑制 CD40L引起的 HUVEC 及MO中DAGIKC通路的变化。并显著降低持续相胞浆内钙水平,而对快速 相无影响。 本研究中我们还观察了正常对照组和急性冠脉综合征(ACS)病人血清与 培养的HUVEC及M。共同孵育12小时后,发现ACS病人血清中存在能明显 刺激二种细胞分泌基质金属蛋白酶MMPg及MMP3的物质。进一步研究证实 该物质为CD40L。 临床部分我们采用间接兔疫荧光流式细胞术和ELISA法,观察了ACS病 人外周血M。表达CD40、CD40L及血清可溶性CD40L变化。并与冠脉造影结 果?


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