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小鼠常染色体显性遗传型多囊肾病基因1胚胎干细胞基因打靶研究

郁胜强  
【摘要】:常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)是一种常见的单基因遗传性疾病。 在美国,其发病率为1/400~l/1000。主要表现为囊肿形成和进行性增大,60岁 时大约50%患者进展至终末期肾病(ESRD),需要血液透析或肾移植。另外, 此疾病可引起肾外器官病变,最常见的是肝脏囊肿。 ADPKD是一种遗传异质性疾病。目前,己知引起ADPKD的基因有三个, 分别称为PKD1、PKD2和PKD3。PKD1位于16号染色体短臂1区3带3亚带 (16pl3.3);PKD2位于4号染色体长臂2区2带和2区3带(4q22-23);PKD3 尚未定位。PKD1于1995年定位克隆。整个基因组序列约为52kb,外显子共有 46个。全长转录子约14kb。5’端部分在同一染色体上有多个重复序列区,3’端 大约3.5kb的cDNA序列为单拷贝区。大约85%的ADPKD患者由此基因引起。 小鼠pkd1基因位于17号染色体,整个基因为单拷贝,全长转录子于1997年克 隆。 ADPKD的发病机理还不甚清楚,也没有特异的治疗方法。多囊肾病的动 物模型为研究肾脏囊肿形成的分子背景以及寻找治疗新药提供了极为有用的工 具。以往通过化学物质诱导、自身突变筛选和受精卵癌基因微注射等方法获得 的动物模型存在各种缺点,尚不能满足研究需要。通过胚胎干细胞基因打靶途 径获得的转基因动物模型是最为理想的模型,可人为地改造、修饰动物基因, 以得到相应的表现型,从而模拟人类遗传病。 本研究利用己知的小鼠pkd1基因cDNA序列,参考人PKD1基因cDNA 序列,用PCGENE软件自行设计引物,引物位于小鼠pkd1基因15外显子内。 抽提正常小鼠基因组DNA,用设计的引物以基因组DNA为模板行PCR扩增, 所得产物片段克隆进pGEM-T载体,PCR、酶切电泳分析鉴定出正确的重组子 后进行测序,结果表明与GENBANK报道一致。以Eco R I酶切pGEM-pkd1所 得片段为探针,用噬斑原位杂交技术筛选129SvTer小鼠基因组DNA噬菌体文 库(λM129/MboI),经过四轮筛选,得到一个阳性克隆;对该克隆的插入片段进


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