钾通道活性与培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡关系的研究

【摘要】：目的：低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）是 呼吸系统常见病症，其病理基础是肺小动脉收缩反应增强和结构重建。近 年通过膜片钳技术，发现肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）钾通道在急慢性缺氧时活性降低是导致平滑肌收缩 的重要原因。HPH血管结构重建过程中，PASMCs增殖占有重要地位，而 血管壁的构成由细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡决定，因此PASMCs凋亡 的作用同样不可忽视。有作者根据抑制钾通道活性可使膜电位降低、电压 依赖性钙通道开放及Ca2+内流增加，推测钾通道活性降低很可能在 PASMCs增殖过程中起重要作用。一氧化氮（nitric oxide，NO）具有开放 PASMCs钾通道的作用，同时又能影响其增殖和凋亡；胸腺细胞、恶性星 形细胞瘤细胞、皮质神经元细胞等的凋亡都与钾通道活性有关；钾通道开 放剂可以明显减轻HPH的病理改变。是否可以由此推断出钾通道活性改变 在PASMCs增殖和凋亡过程中同样起着重要作用呢？本实验就是想通过观 察钾通道阻断剂、开放剂、NO对培养PASMCs钾通道活性以及增殖和凋 亡的影响来明确这一问题。 方法： （1）分离和培养大鼠PASMCs显微镜下摘取大鼠肺内肺动脉，以含胶 原酶、弹性蛋白酶的无钙Hank's液消化细胞并以10％FCS PRMI-1640进行 培养，免疫组化法鉴定PASMCs纯度。 （2）急性分离和培养的PASMCs钾通道特性及开放剂、阻断剂、NO对 其的作用采用全细胞式膜片钳技术进行研究，各种不同浓度的钾通道阻 断剂、开放剂以及NO供体溶液通过灌流系统以1.5～2ml／min速度给药。 电流记录采用电压钳制（Voltage clamp）方式，维持电位在-70mV，从-40mV 至＋80mV，每隔10mV阶跃去极化一次，脉冲时间为250ms，间隔时间为 10s，引出外向钾电流。 （3）钾通道阻断剂、开放剂、NO对PASMCs增殖和凋亡的作用，以及 —— －2－ 纫 昙 钾通道阻断剂、开放剂对PASMCs增殖和凋亡作用与钙通道的关系 培养 5叶 0代的 PASMCS加人不同浓度的上述药物后，以非同位素增殖试剂盒测 定 A490历30值反映细胞数，以’H－TdR掺入法测定 cpm值反映 DNA合成， 以流式细胞仪测定细胞周期。培养 5叫 0代的 PASMCS同时加入钾通道阻 断剂和钙通道阻断剂，或同时加入两种通道开放剂，上述相同方法检测细 胞增殖。 培养 5叶 0代的 PASMCs加入不同浓度的上述药物后，以 HE染色、荧 光显微镜、Annexin V凋亡检测试剂盒流式细胞仪方法检测细胞凋亡。培养 5叶 0代的 PASMCS同时加入钾通道开放剂和钙通道开放剂，流式细胞仪检 测细胞凋亡。 结果： 山联合使用胶原酶和弹性蛋自酶可快速获得活力较好的PA S M C S，培 养细胞的纯度经免疫组化法鉴定达98％。 （2）膜片钳实验发现急性分离的PASMCs钾电流（I）在＋60mV 时为 2001．90土332．14pA，培养 PASMCS IK在十60＊V时为 633＊ 士sl．47pA，两者 相差非常显著（p＜0刀 1人 Kv通道特异性阻断剂 4AP在 smmol几浓度时使 Ix在＋60mV时减小为 242＊7土33＊ZpA，与对照组相差非常显著（p＜0＊1）。 10mmol／L TEA在＋60mV使 Ix减小到302．26土31．20pA，20mmol／L时减小 到 100＊ 士10．18pA，均与对照组有非常显著差异（p＜0＊1）。100if h。I几 的钾通道开放剂Pin和NO供体SNAP在＋60mV－时分别使IK升高到1223．54 土门 石spA和899玉 土48．63pA，与对照组有非常显著差异（p＜0．of）。 u）Kv通道阻断剂个＊P浓度在＞2．smm＊几时有明显的细胞毒性作用， 而＜2．smmol几时其A490历30和cpm值与对照组无显著差异。TEA在3 10mmol／L时其 A490／630和 cpm值均高于对照组（p＜0．05或 0＊1），但当 其浓度＞25mmol几时，出现与4－＊P类似的细胞毒性作用，只是程度稍轻。 25 umol／L—500 umol儿的 Pin和 SNAP呈剂量依赖性地减少 10 ％FCS培养 PASMCS的A490／630和CpC值，与对照组比较相差非常显著（p＜0刀1）。 500 umol几的nn和 SNAP非常显著地增加 GVG；期细胞比例，减少 S期和 G。／M期细胞比例。TEA和钙通道阻断剂Nif同时使用时，除20mmol／L组 使DNA合成显著增加外，其余浓度与对照组均无差异。钙通道开放剂Bay —— －3－ 绚 昙 一 可以明显抑制 Pin对 PASMCs增殖的作用 巾＜0．01人 HE染色和荧光显微镜检查经Nn和SNAP处理的PASMCs，均观察到 典型特征的凋亡细胞。流式细胞仪检?