钾通道活性与培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡关系的研究
【摘要】:目的:低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是
呼吸系统常见病症,其病理基础是肺小动脉收缩反应增强和结构重建。近
年通过膜片钳技术,发现肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth
muscle cells,PASMCs)钾通道在急慢性缺氧时活性降低是导致平滑肌收缩
的重要原因。HPH血管结构重建过程中,PASMCs增殖占有重要地位,而
血管壁的构成由细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡决定,因此PASMCs凋亡
的作用同样不可忽视。有作者根据抑制钾通道活性可使膜电位降低、电压
依赖性钙通道开放及Ca2+内流增加,推测钾通道活性降低很可能在
PASMCs增殖过程中起重要作用。一氧化氮(nitric oxide,NO)具有开放
PASMCs钾通道的作用,同时又能影响其增殖和凋亡;胸腺细胞、恶性星
形细胞瘤细胞、皮质神经元细胞等的凋亡都与钾通道活性有关;钾通道开
放剂可以明显减轻HPH的病理改变。是否可以由此推断出钾通道活性改变
在PASMCs增殖和凋亡过程中同样起着重要作用呢?本实验就是想通过观
察钾通道阻断剂、开放剂、NO对培养PASMCs钾通道活性以及增殖和凋
亡的影响来明确这一问题。
方法:
(1)分离和培养大鼠PASMCs显微镜下摘取大鼠肺内肺动脉,以含胶
原酶、弹性蛋白酶的无钙Hank's液消化细胞并以10%FCS PRMI-1640进行
培养,免疫组化法鉴定PASMCs纯度。
(2)急性分离和培养的PASMCs钾通道特性及开放剂、阻断剂、NO对
其的作用采用全细胞式膜片钳技术进行研究,各种不同浓度的钾通道阻
断剂、开放剂以及NO供体溶液通过灌流系统以1.5~2ml/min速度给药。
电流记录采用电压钳制(Voltage clamp)方式,维持电位在-70mV,从-40mV
至+80mV,每隔10mV阶跃去极化一次,脉冲时间为250ms,间隔时间为
10s,引出外向钾电流。
(3)钾通道阻断剂、开放剂、NO对PASMCs增殖和凋亡的作用,以及
——
-2-
纫 昙
钾通道阻断剂、开放剂对PASMCs增殖和凋亡作用与钙通道的关系 培养
5叶 0代的 PASMCS加人不同浓度的上述药物后,以非同位素增殖试剂盒测
定 A490历30值反映细胞数,以’H-TdR掺入法测定 cpm值反映 DNA合成,
以流式细胞仪测定细胞周期。培养 5叫 0代的 PASMCS同时加入钾通道阻
断剂和钙通道阻断剂,或同时加入两种通道开放剂,上述相同方法检测细
胞增殖。
培养 5叶 0代的 PASMCs加入不同浓度的上述药物后,以 HE染色、荧
光显微镜、Annexin V凋亡检测试剂盒流式细胞仪方法检测细胞凋亡。培养
5叶 0代的 PASMCS同时加入钾通道开放剂和钙通道开放剂,流式细胞仪检
测细胞凋亡。
结果:
山联合使用胶原酶和弹性蛋自酶可快速获得活力较好的PA S M C S,培
养细胞的纯度经免疫组化法鉴定达98%。
(2)膜片钳实验发现急性分离的PASMCs钾电流(I)在+60mV 时为
2001.90土332.14pA,培养 PASMCS IK在十60*V时为 633* 士sl.47pA,两者
相差非常显著(p<0刀 1人 Kv通道特异性阻断剂 4AP在 smmol几浓度时使
Ix在+60mV时减小为 242*7土33*ZpA,与对照组相差非常显著(p<0*1)。
10mmol/L TEA在+60mV使 Ix减小到302.26土31.20pA,20mmol/L时减小
到 100* 士10.18pA,均与对照组有非常显著差异(p<0*1)。100if h。I几
的钾通道开放剂Pin和NO供体SNAP在+60mV-时分别使IK升高到1223.54
土门 石spA和899玉 土48.63pA,与对照组有非常显著差异(p<0.of)。
u)Kv通道阻断剂个*P浓度在>2.smm*几时有明显的细胞毒性作用,
而<2.smmol几时其A490历30和cpm值与对照组无显著差异。TEA在3
10mmol/L时其 A490/630和 cpm值均高于对照组(p<0.05或 0*1),但当
其浓度>25mmol几时,出现与4-*P类似的细胞毒性作用,只是程度稍轻。
25 umol/L—500 umol儿的 Pin和 SNAP呈剂量依赖性地减少 10 %FCS培养
PASMCS的A490/630和CpC值,与对照组比较相差非常显著(p<0刀1)。
500 umol几的nn和 SNAP非常显著地增加 GVG;期细胞比例,减少 S期和
G。/M期细胞比例。TEA和钙通道阻断剂Nif同时使用时,除20mmol/L组
使DNA合成显著增加外,其余浓度与对照组均无差异。钙通道开放剂Bay
——
-3- 绚 昙
一
可以明显抑制 Pin对 PASMCs增殖的作用 巾<0.01人
HE染色和荧光显微镜检查经Nn和SNAP处理的PASMCs,均观察到
典型特征的凋亡细胞。流式细胞仪检?
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