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庚型肝炎病毒转基因小鼠模型的建立及其特性研究

胡卫江  
【摘要】: GBV-C/HGV是美国Abbott实验室Simons及Genelabs实验室Linnen等人 分别于1995年、1996年独立克隆的新型致病因子,分别称为GBV-C及HGV。 由于核酸和蛋白水平的高度同源性,二者被认为是同一种病毒,本文统称为 HGV。HGV是单正链RNA病毒,长约9400nt,编码2900左右氨基酸,含一个 开读框架,基因组5'端结构基因依次编码核心蛋白、包膜蛋白1和包膜蛋白2; 3'端非结构基因依次编码非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B, 在5'及3'端侧翼分别为5'及3'非编码区,因此HGV被认为与HCV一样,属黄 病毒科成员。本实验室于1998年也成功克隆了HGV的全长cDNA,命名为 HGVqz(GenBank登录号为AF081782)。 HGV的进一步研究受阻于无合适的HGV研究体系,其宿主范围窄,只感染 人和黑猩猩等高等灵长类动物,因此建立转基因小鼠使常规的实验动物“感染” HGV,并对其进行确切的研究是本文主要解决的问题。转基因动物已成为研究 新型病毒的一种工具,尤其对于宿主范围很窄的病毒。本文即以HGV的全长 cDNA HGVqz为材料,以转基因小鼠为实验体系研究HGV的基本生物学性质, 对HGV的复制、蛋白表达及剪切、致病性、嗜肝性等问题进行初步探讨。 一、次全长HGV转基因小鼠HGVcns3TGM的建立及研究 将包含HGV全部结构基因及部分非结构基因的表达载体pHGVns3转染至 Chang liver细胞中进行体外表达,得到了143KD的表达产物,随后用限制性内 切酶SalI及XmnI酶切质粒得到5.6Kb目的片段,以此片段为外源基因,利用显 微注射法产生了次全长HGV转基因小鼠,基因组DNA PCR及Southern blotting 证明,该小鼠外源基因可稳定传递,各组织RT-PCR结果表明HGV基因可以在 肝细胞及淋巴细胞内转录,免疫组化结果显示,蛋白表达主要位于肝细胞。常规 病理学切片观察,某些转基因小鼠有轻度的肝细胞损伤。这些结果显示:转基因 小鼠在体内不存在免疫反应的情况下,HGV的蛋白产物在肝细胞的表达可能会 引起肝细胞损伤。但由于此小鼠所表达的仅仅是HGV部分基因,有必要对HGV 全长基因在转基因小鼠体内的状况作进一步探讨。 二、全长HGV转基因小鼠HGVFTGM的建立及研究 HGVqz全长基因为9373bp,共编码2874个氨基酸,编码区位置从第442 位核苷酸开始至9063位为止。起始位点的氨基酸为MGPP,与其它HGV全长 基因的起始氨基酸序列(MAVL)有较大差异,但据分析它仍具有保守的剪切位 点。 第二军医大学博上论文 摘要 利用此克隆构建由不同启动子调控的HGV表达载体,将两种表达载体及 HGV全长基因转染至Chang liver及NIH 3T3细胞中进行体外表达,结果发现 HGVqZ可以在体外表达分子量约 31 OKD的 HGV前体蛋白,但不能完成前体蛋 白的剪切。随后以HGV全长基因为目的片段,用显微注射方法产生了整合HGV 全长基因的F。[IlldCf ’J’鼠。遗传分析发现,FI及FZ代转基因小鼠阳性率分别为 71%、76%,外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传且随机整合。 转基因小鼠各组织 RT-PCR检测表明:HGV RNA可以在多个组织检测到, 而且单核细胞、肝、肾、肺等若干组织还有复制中间体负链RNA的存在,HGV RNA也可分泌至血清中。 转基因小鼠若干组织的免疫组化实验表明:HGV基因可以在转基因小鼠肝。 肾、肺等多个组织内表达,各个组织的表达强度不一致,以肝脏表达最强,但 HGV抗原在肝小叶中的分布并不均匀,以中央静脉周围最多。血清ELISA结果 表明 HGV抗原还可以分泌到血清中。肝、肾、肺、脾等组织的Western blotting 实验结果表明:HGV蛋白前体在转基因小鼠体内被剪切成若干大小不同的片 段,杂交所得到的片段应为含EZ蛋白的剪切中间体。实验结果表明体内外的实 验体系明显存在差异,转基因小鼠体系更有利于HGV生物学特性研究。 为进一步检验 HGV转基因小鼠是否具有传染性,用 HGV RNA阳性的转基 因小鼠血清感染M。It斗细胞,发现M。It-4细胞可以支持HGV短期复制,细胞 上清的Western七lotting实验表明:HGV病毒蛋白从感染的第9天开始出现,直 至第 19天。细胞上清中 RNA与病毒蛋白出现的一致性提示:细胞上清中可能 具有HGV的病毒颗粒。此转基因小鼠极象HGV自然感染的宿主,可将HGV分 泌至血清中并具传染性。 常规病理学切片观察显示:转基因小鼠基本不发生明显的病理学变化,只有 肝脏组织有轻微的肝细胞浊肿,其他组织均未见异常。血清酶学分析显示,转基 因小鼠与正常小鼠血清转氨酶水平无明显差异,极个别有转氨酶升高现象。血清 ELISA实验证明转基因小鼠体内不存在HGV的抗体,电子显微镜观察显示转基


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