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白念珠菌钙调蛋白基因(CMD1)缺陷菌株的构建及CMD1功能性基因的初步研究

陈孙孝  
【摘要】: 本课题采用定点突变的方法,构建白念珠菌钙调蛋白基因定点 突变cmdl表达质粒,转化入CMD1缺陷菌株,研究cmd1定点突变对 重组菌株的生长周期及形态发生的影响,进一步从分子水平探讨白 念珠菌钙调蛋白在致病机制中的作用。本课题分三部分:1、白念钙 调蛋白基因缺陷重组菌株的构建和鉴定。先将含cmd1::TRP1置换序 列的质粒Ⅰ转入酵母菌株YPH501,经省却Trp培养基和Southern blothing筛选出发生基因置换的重组菌株,其次将含URA3和CMD1 表达序列的质粒Ⅱ转入,经省却Trp/Ura培养基筛选出阳性重组菌 株,减数分裂后剖分四分体,经省却Trp/Ura培养基筛选出白念钙 调蛋白基因缺陷TRP1单倍体菌株,再经基因置换成功构建了预期的 白念钙调蛋白基因缺陷HIS3单倍体菌株。2、白念钙调蛋白定点突 变重组菌株的构建和鉴定。设计使CMD1苯丙氨酸定点突变成丙氨酸 的引物,采用两步PCR法进行单点和两点突变PCR扩增,并插入穿 梭质粒Ⅳ(含TRP1序列)构建定点突变重组质粒,转入白念钙调 蛋白缺陷HIS3单倍体,成功构建了白念钙调蛋白定点突变重组菌 株。实验结果表明白念钙调蛋白F89+、F92+和F141+单点突变和 F89+F141+两点突变均为非致死性突变,F89+F92+和F92+F141+两点 突变为致死性突变。3、白念钙调蛋白定点突变对重组菌株的影响。 将白念钙调蛋白定点突变单倍体菌株分别接种于省却Trp平板,置 30℃、36℃、37℃和37.5℃恒温培养。采用流式细胞仪、光镜、电 镜分析突变株的生长速度、形态和DNA合成周期。结果表明,当第 92位苯丙氨酸定点突变成丙氨酸时重组菌株具有温度敏感性,再与 89位或141位苯丙氨酸组成两点突变时引起重组菌株死亡,即致死 性突变;而89位或141位苯丙氨酸单独定点突变成丙氨酸时,对重 组菌株的形态、生长速度、DNA合成周期等没有影响(P>0.05),也 不形成温敏株;但89位和141位苯丙氨酸一起定点突变成丙氨酸时 重组菌株也具有温敏性。两株温敏菌株的形态、生长速度和DNA合 成周期与对照组相差显著-p州.DSL 因此,白念钙调蛋白C端球状_ 结构中的三个苯丙氨酸尤其是第92位苯丙氨酸在维持白念珠菌钙调 蛋白正常功能中具有重要地位。 在白念珠菌的双相转换中,菌丝相的出现是其处于致病状态的 标志之一,白念钙调蛋白基因F92+或F89+F141+定点突变后抑制了 重组菌株形态的正常发生和DNA合成。因此,可以初步推断白念珠 菌钙调蛋白C端球状结构中的三个苯丙氨酸尤其是第92位苯丙氨酸 在白念珠菌的致病性中具有重要作用。


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