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类风湿性关节炎的反义VEGF基因治疗实验研究

王建华  
【摘要】:滑膜血管翳形成是类风湿性关节炎(RA)的主要病理特征,大量研究发现滑膜组织中血管内皮生长因子(VEGF)的过度表达是引起滑膜血管翳形成的主要因素。如果能够抑制RA发病过程中血管内皮生长因子的过度表达,将有可能抑制滑膜血管翳的形成,对RA产生一定的治疗作用。采用VEGF抗体或受体拮抗剂进行关节腔注射是一种方法,但注射的外源性蛋白质半衰期短,并且容易引起免疫排斥反应,所以应用受限。为了克服生物制剂(抗体,受体拮抗蛋白等)关节腔注射疗法半衰期短,局部反应大的缺点,我们采用滑膜组织基因转染的方法,将表达反义VEGF基因的腺病毒载体导入病变的滑膜组织,在基因水平上千预病变滑膜的VEGF过度表达,并探讨其对RA形成的影响。 第一部分VEGF在大鼠类风湿性关节炎模型中的动态表达 目的:观察大鼠类风湿性关节炎形成过程中滑膜组织VEGF的动态表达。 方法:采用皮下多点注射Ⅱ型胶原的方法诱导大鼠胶原性关节炎模型,采用免疫组化,计算机图像分析技术观察VEGF在滑膜组织中的表达,并分析VEGF表达与关节肿胀及滑膜血管增生的相关性。 结果:大部分(90%)大鼠在胶原致敏后2周左右发病,主要表现为关节红肿,活动受限。病理切片显示:3周左右滑膜组织有典型的滑膜血管翳形成,并可见到关节软骨受血管翳的侵蚀和破坏。X线摄片显示踝关节骨质疏松,关节面呈点状侵蚀破坏、关节间隙变窄等影像学改变。免疫组化染色显示:大鼠病变滑膜组织有高强度的VEGF信号表达,VEGF阳性细胞主要是滑膜衬里层细胞及滑膜下层的成纤维样及巨噬样组织细胞;计算机图像分析结果提示,VEGF的表达时相与关节肿胀及血管增生的过程有较强的相关性,并且两组变量的动态变化趋势一致。 结论:1采用 型胶原皮下注射的方法可以成功诱导大鼠胶原性关节炎动物模型;2 VEGF 在胶原性关节炎的发病过程表达增强,它与大鼠关节肿胀和滑膜血管翳形成关系密切。 第二军医大学协士学位论文 骨科专业 第H部分反义VEGF165毒载体的制备 目的:l构建反义VEGF165粘粒载体并制备高滴度的反义VEGF165重组 腺病毒;2用同样的方法制备高滴度的空载体腺病毒bAxCAW)及lacz报告基 因腺病毒OAxC皿acZ卜 方法:采用Takara公司的V型腺病毒载体试剂盒提供的pAxCAwt粘粒进 行反义VEGF165粘粒载体的构建。由于人与大鼠VEGF基因高度同源,VEGF165 基因片段采用RT—PCR的方法从人脾组织中抽提获取。将pAxCAwt粘粒的SWal I位点切开后,插入经Klenow酶补平的VEGF165 CDNA片段;然后通过酶切 筛选、测序鉴定选择反向插入的克隆,获得反义VEGF165粘粒。粘粒与腺病 毒末端蛋白复合物(TPC)共同转染293细胞,在293细胞中同源重组,并利 用293细胞提供的EI,E3基因产物组装病毒颗粒。获得第一代重组反义 VEGF165。第一代腺病毒经过筛选、鉴定后重复感染293细胞,经过多次扩增, 最后获得第四代腺病毒。 .结果:获得了高滴度的第四代反义VEGF 65重组腺病毒,并用同样方法获 得了空载体腺病毒及lacz报告基因腺病毒。 结论:采用腺病毒DNA末端蛋白共转染的方法可以获得高滴度的反义 ‘VEOF165及 lacz重组重组腺病毒。 第三部分体外实验:反义VEGF165基因转染对体外 培养的滑膜细胞分泌VEGF的影响 目的:l 评价腺病毒对体外培养的滑膜细胞的感染效率;2观察反义 VEGF 65腺病毒对滑膜细胞 VEGF基因转录和翻译的影响。 方法:1将不同滴度的pAxC肌acZ报告基因腺病毒转染滑膜细胞,通过X 一gal染色的方法观察腺病毒感染滑膜细胞后基因的表达情况,并绘制感染效率 曲线。二将反义VEGF 65腺病毒转染滑膜细胞,通过Northemthlot的方法检测 VEGF的基因转录水平。3采用ELISA方法检测反义VEGF165基因转染后对 滑膜细胞上清液中 VEGF 24h分泌率的影响。 结果:l报告基因感染效率曲线效率曲线显示;当腺病毒浓度为50moi时, 感染效率达 70o/;当浓度为 100md时,感染效率为 98 %;浓度超过 100md时 c 3 第二军医大学博士学位论文 骨科专业 几乎可以感染100%的滑膜细胞。二N。rib*_杂交结果显示:反义基因转染滑膜 细胞3天后,VEGF 65基因的转录即受到明显抑制,4天后抑制更加明显,5 天后几乎检测不出阳性杂交信号。3 ELSA检测显示:转染6天后滑膜细胞 分泌 VEGF的


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