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幽门螺杆菌VacA毒素的纯化及其作用机理研究

杜奕奇  
【摘要】: 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃MALT瘤的发生发展有密切关系,发展中国家60-80%的人群有Hp感染。VacA(vacuolating cytotoxin)是Hp分泌的一种毒素,于体外可导致哺乳动物真核细胞产生空泡变性,在Hp的致病过程中起重要作用,但其空泡毒性作用的确切机理尚不清楚。开展VacA的研究工作需要大量的VacA抗原,Hp的浓缩上清虽具有明显的空泡活性,但因其蛋白成分复杂而不能完全取代高纯度的VacA用于研究。因此,本研究的目的是通过对多种Hp液体培养方法及液相层析方法的筛选,建立一种简便、可行、可靠的VacA纯化流程,从而使该抗原的大量制备成为可能,为进一步研究VacA毒素的致病机理,包括VacA受体的研究提供物质基础。同时评价中性红摄入法(NRU)检测细胞空泡毒性的应用价值,为研究VacA的作用机制提供可靠的技术方法。在上述基础上,采用蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)及蛋白酪氨酸激酶(PTK)的抑制剂,观察其对VacA空泡毒性的影响,探讨VacA对胃粘膜上皮细胞信号转导通路的作用及VacA受体的特性,并为临床治疗有毒Hp菌株感染提供新的思路。1.幽门螺杆菌液体培养上清中VacA毒素的粗提: 选择两种不同的布氏肉汤成分TSB及MHB,加入不同的支持剂小牛血清(FBS)及CD,组成4组液体培养基TSB+FBS,TSB+CD,MHB+FBS及MHB+CD。刮取HpCCUG17874菌落至液体培养基中,于37℃微需氧环境150rpm振荡培养72h,于培养前后分别检测细菌浊度。结果显示TSB+CD组3天后细菌密度达10.33±1.76×10~8CFU/ml,低于TSB+FBS组(13.17±1.15),但差异不显著。二者培养前后的浊度比及菌体湿重均显著高于以MHB为培养基组 第二军医大学 博士学位论文 中文初要 冲叼.of)。ii培养基组内加入不同支持物(CD或FBS)时,Hp 扩增效果相差不显著0列.05)。通过50%饱和度的硫鞭沉淀4组 培养液上清中的蛋白,并经 10mmol几 PB缓冲液透析及滤膜离心后 制成 Hp上清浓缩液。LOWry七法测得 250pl浓缩上清内蛋白含量, TSB+CD组蛋白浓度平均为 2.4410.39 m令ml,显著高于 ii+CD组 (0.52 10.19mg/ffil,P<0.of人含 FBS组蛋白浓度较高。各组样品 SDS-PAGE电泳结果显示含HB组Hp上清浓缩液中均可见清晰的 95kDa条带(VacA),但其中以 FBS为支持物组蛋白条带数量多, 尤以 66ica条带明显。PX CD为支持物组可见 10余条带,大部分位 于 66ma kX T。kX ii为培养基组均来见 95ica的靶片段,且蛋白 条带较TSB组明显减少。 将各组样品经倍比稀释后与胃癌SGC刁9*细胞共同孵育24h, 空泡活性观察结果显示空泡均位于核周胞浆内,大小不均,布满整个 胞浆。TSB-CD组及HB+FBS组样品产生空泡明显,于 1:5滴度 空泡形成细胞均达 100%,空泡比例随毒素滴度递减,而以 ii为 培养基组浓缩上清液无明显空泡活性。NRU于550urn检测光吸收值 (A。,。),TSB+FBS组各滴度(1:5-l:40)及 TSB+CD组各酒度 门:5~1:ZO)均产生明显的空泡活性。两组均以1:5滴度时山扣最高, TSB+FBS组为 0.68t0.07,高于%B+CD组(0.5410.09),但差异不 显著(P>0.05)。且两组均随毒素滴度的降低呈现明显的递减趋势。 结果表明,TSB+CD培养基液体培养的效果较好,可以代替含血清培 养基用于Va。A蛋白的分离纯化。 采用TSB+CD组浓缩上清,观察孵育时间长短对空泡毒性的影 响,结果表明空泡活性具有明显的时间依赖性。当毒素滴度为1:2时, 孵育 4h即产生明显空泡(A”。=0.43L0刀6),至 16h达最高吸收值(A”。 =0.71 10.03),至 24h时因细胞大量死亡,A。。。反而下降。l:5毒素滴 度的时间曲线较1:2滴度更恰当反应出空泡活性随孵育时间变化的特 -2- 第二军医大学 博士学位论文 中文摘要 性。NRU对空泡的判断与细胞计数法基本符合,且 1:40滴度组空泡 细胞比例为 0.8土0.3%(-*但 NRU检测结果显示 A55。=0* 2土0*4, 与空白对照相比仍有显著差异(P<0刀5)。结果表明,NRU较细胞计 数法有更高的敏感性,且有助于空泡活性的定量评价。 2.Va“毒素的纯化: 地浓缩上清进一步采用吸附层析、疏水层析、阴离子交换层析 及撇过滤方法进行 VacA蛋白的纯化。由几 培养液中提取的蛋白 透析样品 sml上样于羟基磷灰石柱,流速 0.35 mlimin,分 lmlj管收 集,经 10。Oil PB洗脱出现A、B两峰,A峰最高吸收值达278llLAU, B峰最高达 252帆U。再以 10。OI/L-400。Oil PB不连续梯度洗 脱时出现 C峰,吸收值为 15haU。经 N’RU检测空泡活力存在于 A 峰。共收集A峰样本约sml,予以 50%饱和度的硫鞭沉淀蛋白, 经 60nunol/L Tis(pH7.7)缓冲液透析。再上样于Phellylsepharose CL*B疏水层析柱,用含0.5 mol几则几迢O。的 60nunol/L Tis洗脱, 出现 A峰,最高吸收值 124haU,继续予以 60mOI/L TriS洗脱出 B


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