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腺病毒介导血管内皮生长因子B基因转染慢性缺血心肌血管新生的研究

董书强  
【摘要】:缺血性心脏病(IHD)是当代人类发病率和致死率较高的疾病之一,由于冠状 动脉的狭窄和闭塞产生组织供血和供氧缺乏,产生心绞痛、心肌梗死、心律失常、心 功能衰竭和猝死,目前主要的治疗措施是开胸手术进行冠状动脉旁路移植(CABG)、 经皮腔内球囊血管扩张(PTCA)或者药物治疗,尽管已取得了很大的进步,但仍有 约5%的患者因严重而弥漫的病变、缺乏血管桥和吻合血管以及高手术危险等而不适 合以上的治疗措施。 各种血管生长因子的相继发现给IHD患者的治疗带来了希望,心肌缺血可诱导 一些生长因子的产生形成一定数目的侧枝血管,但不能满足自身的需要,研究者开始 尝试增加缺血区生长因子浓度的方式,以其通过增加侧枝血管的生长而减轻心肌缺 血、预防心肌梗死和保存心脏的功能,即“治疗性血管新生”(Therapeutic Angiogenesis),近年的研究预示这将为IHD的治疗提供一条全新而有效的途径。 目前研究的血管生长因子主要集中在血管内皮生长因子A(VEGF—A)、成纤 维细胞生长因子(FGF)和血管形成素(angiopoietins)等,由于各自的生物学特性和 作用特点不同,缺乏相互比较,尚不能确定何者为首选。新近发现的血管内皮生长因 子B(VEGF-B)结构与VEGF-A相似,分布广泛,在心脏较为丰富,与 VEGF家族 的受体之一 VEGFR-1和 neuropolin-1结合,研究表明内皮细胞和其周细胞存在编码 VEGF-B的mRNA,VEGF-B能够促进培养的血管内皮细胞(ECs)的生长,并增加 纤溶酶的活性从而调节血管外基质的降解、细胞粘附和迁移,敲除VEGF-B基因的鼠 心脏体积减小阻塞冠状动脉后的恢复受限,提示该因子影响冠状血管的发育和生长, 提示有潜在的治疗作用。与 VEGF不同的是,缺氧并不明显增加VEGF—B mRNA的 表达,缺血心肌VEGF-B的缺乏可能是内在血管生长不足的原因之一,目前关于 VEGF-B的血管新生作用的研究尚未见报道。 基因治疗是目前研究的热点,腺病毒介导的基因转移优于直接应用蛋白和质粒 载体,为了探讨腺病毒介导VEGF-B基因对缺血心肌的血管新生作用,我们首先构建 了编码人VEGF-B基因的复制缺陷的重组腺病毒(Ad.VEGF-B)载体,在体外研究证 实对血管内皮细胞具有促增殖作用的基础上,直接注射猪慢性缺血心肌以评价在体应 用的效果。 2 男二罩巨大誉协士够位锗大 申穴凶昙 们叱外斗专业 — —: 1.VEGFB腺病毒粘粒载体(pAxCAwtEGFB CDNA)的构建 抽提人心肌组织总 RNA,经 RT-PCR合成 VEGFB cDNA,扩增后酶切鉴定, 将纯化的目的基因插入测序载体 pUC,转化感受态大肠杆菌 TG;进行扩增和抽提, 获得正确的目的基因 VEGF-B CDNA,插入有腺病毒基因组的粘粒载体 pAxCAWt,扩 增后挑选插入方向正确的克隆。 2.VEGFB基因重组腺病毒载体Ad.VEGF-B的构建 应用磷酸钙共沉淀法将DNA-TPC和重组粘粒pAxCAwtEGF-B CDNA转染293 细胞,培养8~18天后挑选病毒克隆,同样的方法构建表达大肠杆菌p一半乳糖昔酶 的LacZ基因腺病毒载体,经限制性内切酶酶切鉴定正确的病毒克隆进一步扩增后氯 化锥梯度超速离心,应用TICD扣法测定滴度。以Ad.LgCZ感染Hela细胞,经X名al 染色确定转染效率,并初步观察转染后细胞生长和形态评价其毒性。 3.Ad.VEGFE体外转染心肌细胞和对血管内皮细胞促增殖作用的研究 分离培养胚胎鼠心肌细胞(FCM)和成鼠主动脉内皮细胞(ohCS),免疫组化 鉴定,分别以不同MOI(每个细胞的病毒噬斑形成单位pm/cell)值的Ad儿acZ转染 FCMs、RAECs,应用X唱al染色测定转染效率,以MOI值20的AdVEGF8感染FCMs 和 RAECs,以 Ad.LacZ、PBS为对照,转染后 1、3、7天进行 RTICR检测其转录, 同时应用 Western Blot检测转染后细胞培养上清 VEGF-B的表达。MTh法测定 Ad.VEGFB转染后7天内对RAECS的增殖作用。 4.Ad.VEGFB转染慢性缺血心肌促血管新生作用的研究 健康家猪14只,体重25~35kg,全麻下左第四肋间前外侧切口,分出左回旋支 主干,放置内径2.snun的ineroid环。4周后冠状动脉造影确定其闭塞,分组用药。 组1(Ad.VEGF-B组)5只,组*(Ad工acZ组)5只,组*(PBS组)4只,缺血区 共注射 10点,每点 100 nl,病毒量为 10vfiJ,组H和组*于 3、7、28天各处死 1只 动物,应用X唱al染色评价慢性缺血心肌的转染效果。注药后28天左右心脏彩超检查 测定节段性收缩期室壁增厚分数和短轴缩短率,体外冠状动脉造影检查侧枝血管的存 在和分布;组织病理学观察心肌缺血、炎症程度,凝血Vlll因子相关抗原抗体免疫组化 染色,200倍视野下进行血管计数。 3 !二旱巨大攀俗士学位论大O丈的臀 用心外科专丛 一: 1.提取的总KNA和mRNA完整


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