腺病毒介导血管内皮生长因子B基因转染慢性缺血心肌血管新生的研究

【摘要】：缺血性心脏病（IHD）是当代人类发病率和致死率较高的疾病之一，由于冠状 动脉的狭窄和闭塞产生组织供血和供氧缺乏，产生心绞痛、心肌梗死、心律失常、心 功能衰竭和猝死，目前主要的治疗措施是开胸手术进行冠状动脉旁路移植（CABG）、 经皮腔内球囊血管扩张（PTCA）或者药物治疗，尽管已取得了很大的进步，但仍有 约5％的患者因严重而弥漫的病变、缺乏血管桥和吻合血管以及高手术危险等而不适 合以上的治疗措施。 各种血管生长因子的相继发现给IHD患者的治疗带来了希望，心肌缺血可诱导 一些生长因子的产生形成一定数目的侧枝血管，但不能满足自身的需要，研究者开始 尝试增加缺血区生长因子浓度的方式，以其通过增加侧枝血管的生长而减轻心肌缺 血、预防心肌梗死和保存心脏的功能，即“治疗性血管新生”（Therapeutic Angiogenesis），近年的研究预示这将为IHD的治疗提供一条全新而有效的途径。 目前研究的血管生长因子主要集中在血管内皮生长因子A（VEGF—A）、成纤 维细胞生长因子（FGF）和血管形成素（angiopoietins）等，由于各自的生物学特性和 作用特点不同，缺乏相互比较，尚不能确定何者为首选。新近发现的血管内皮生长因 子B（VEGF-B）结构与VEGF－A相似，分布广泛，在心脏较为丰富，与 VEGF家族 的受体之一 VEGFR-1和 neuropolin-1结合，研究表明内皮细胞和其周细胞存在编码 VEGF-B的mRNA，VEGF-B能够促进培养的血管内皮细胞（ECs）的生长，并增加 纤溶酶的活性从而调节血管外基质的降解、细胞粘附和迁移，敲除VEGF-B基因的鼠 心脏体积减小阻塞冠状动脉后的恢复受限，提示该因子影响冠状血管的发育和生长， 提示有潜在的治疗作用。与 VEGF不同的是，缺氧并不明显增加VEGF—B mRNA的 表达，缺血心肌VEGF－B的缺乏可能是内在血管生长不足的原因之一，目前关于 VEGF-B的血管新生作用的研究尚未见报道。 基因治疗是目前研究的热点，腺病毒介导的基因转移优于直接应用蛋白和质粒 载体，为了探讨腺病毒介导VEGF－B基因对缺血心肌的血管新生作用，我们首先构建 了编码人VEGF-B基因的复制缺陷的重组腺病毒（Ad．VEGF－B）载体，在体外研究证 实对血管内皮细胞具有促增殖作用的基础上，直接注射猪慢性缺血心肌以评价在体应 用的效果。 2 男二罩巨大誉协士够位锗大 申穴凶昙 们叱外斗专业 — —： 1．VEGFB腺病毒粘粒载体（pAxCAwtEGFB CDNA）的构建 抽提人心肌组织总 RNA，经 RT－PCR合成 VEGFB cDNA，扩增后酶切鉴定， 将纯化的目的基因插入测序载体 pUC，转化感受态大肠杆菌 TG；进行扩增和抽提， 获得正确的目的基因 VEGF－B CDNA，插入有腺病毒基因组的粘粒载体 pAxCAWt，扩 增后挑选插入方向正确的克隆。 2．VEGFB基因重组腺病毒载体Ad．VEGF－B的构建 应用磷酸钙共沉淀法将DNA－TPC和重组粘粒pAxCAwtEGF－B CDNA转染293 细胞，培养8～18天后挑选病毒克隆，同样的方法构建表达大肠杆菌p一半乳糖昔酶 的LacZ基因腺病毒载体，经限制性内切酶酶切鉴定正确的病毒克隆进一步扩增后氯 化锥梯度超速离心，应用TICD扣法测定滴度。以Ad．LgCZ感染Hela细胞，经X名al 染色确定转染效率，并初步观察转染后细胞生长和形态评价其毒性。 3．Ad．VEGFE体外转染心肌细胞和对血管内皮细胞促增殖作用的研究 分离培养胚胎鼠心肌细胞（FCM）和成鼠主动脉内皮细胞（ohCS），免疫组化 鉴定，分别以不同MOI（每个细胞的病毒噬斑形成单位pm／cell）值的Ad儿acZ转染 FCMs、RAECs，应用X唱al染色测定转染效率，以MOI值20的AdVEGF8感染FCMs 和 RAECs，以 Ad．LacZ、PBS为对照，转染后 1、3、7天进行 RTICR检测其转录， 同时应用 Western Blot检测转染后细胞培养上清 VEGF－B的表达。MTh法测定 Ad．VEGFB转染后7天内对RAECS的增殖作用。 4．Ad．VEGFB转染慢性缺血心肌促血管新生作用的研究 健康家猪14只，体重25～35kg，全麻下左第四肋间前外侧切口，分出左回旋支 主干，放置内径2．snun的ineroid环。4周后冠状动脉造影确定其闭塞，分组用药。 组1（Ad．VEGF－B组）5只，组＊（Ad工acZ组）5只，组＊（PBS组）4只，缺血区 共注射 10点，每点 100 nl，病毒量为 10vfiJ，组H和组＊于 3、7、28天各处死 1只 动物，应用X唱al染色评价慢性缺血心肌的转染效果。注药后28天左右心脏彩超检查 测定节段性收缩期室壁增厚分数和短轴缩短率，体外冠状动脉造影检查侧枝血管的存 在和分布；组织病理学观察心肌缺血、炎症程度，凝血Vlll因子相关抗原抗体免疫组化 染色，200倍视野下进行血管计数。 3 ！二旱巨大攀俗士学位论大O丈的臀 用心外科专丛 一： 1．提取的总KNA和mRNA完整