成年大鼠脑内神经干细胞的在体研究

【摘要】：第一部分 成年大鼠中枢神经干细胞的检测及EGF的体内作用 目的：检测成年大鼠脑内神经干细胞存在部位，及表皮生长因子（EGF）对 神经干细胞增殖的影响。 方法：成年健康雄性SD大鼠45只，体重270～320g，随机分为正常组、脑 室注射EGF组、脑室注射溶剂组，每组15只。正常组不给药，EGF组通过 立体定向单侧侧脑室内微量注射技术给予EGF，浓度为0．1mg／ml，微量泵 控制注射速度为 1μl／min，每次5μl，每日 1次，相当于 EGF 500ng／天，连 续给药7天。溶剂组脑室内注射生理盐水，注射量及方法同EGF组。3组中 各有5只处死前给予5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）注射。BrdU通过腹腔注射 给予，剂量 100mg／Kg，每 2小时 1次共 5次。最后一次给药后 1小时，将 大鼠过量麻醉后以4％多聚甲醛动脉灌注固定，取脑标本，进行病理及免疫 组织化学检查。通过神经干细胞的特异性标记物nestin染色阳性细胞计数， 了解神经干细胞的存在部位及数量，通过BrdU标记指数反映神经干细胞的 增殖情况。 结果：在正常成年大鼠的侧脑室室管膜下层及海马齿状回均发现nestin阳性 细胞，大脑皮层及第皿第IV脑室的室管膜下区未见nestin阳性细胞。双重 免疫组化检查发现部分nestin阳性细胞呈BrdU＋双重染色，部分nestin阳 性细胞没有BrdU染色，提示有部分神经干细胞处于相对静止状态。脑室内 给予EGF后nestin阳性细胞明显增加，nestin＋ BrdU＋双重染色细胞明显 增加（P＜0．01）。 结论：成年大鼠侧脑室室管膜下区和海马区存在神经干细胞。这些细胞表达 未成熟细胞的标记物nestin，并有部分细胞不断进行自我更新。脑室内给予 EGF能促进神经干细胞的增殖。 第二部分 脑外伤后成年大鼠神经干细胞的变化及EGF的体内作用 目的：成年大鼠脑外伤后神经干细胞能否代偿性增殖并分化为神经元、神经 胶质细胞，及增殖、分化的调控因素。 方法：成年雄性SD大鼠60只，体重270～3209，随机分为正常对照、外伤、 外伤＋EGF 3组，每组20只。外伤组采用大鼠液压脑损伤模型，打击部位为 右侧大脑半球，打击强度 1．5 8UI’－，造成大鼠中度脑损伤。EGF组于伤后第 1 天开始进行脑室内给药，连续给药7天，方法同第一部分。分别在伤后1周 和8周，灌注固定动物（每组各10只），取脑组织标本。每组有5只动物在 灌注前给予BrdU腹腔注射。BrdU给药及灌注固定方法同第一部分。脑标本 进行病理及兔疫组织化学检查。通过检测nsetin阳性及BrdU阳性细胞数了 解神经干细胞在脑外伤后能否增殖，通过不同种类的细胞特异性标记物 NSE、GFAP、nestin分别与BrdU双重染色细胞的计数来观察有没有新生神 经元、神经胶质细胞出现，以了解神经干细胞在外伤后能否进行增殖、分化， 及EGF对增殖分化的影响。各组动物还进行了爬坡实验、行走实验、平衡实 验，以了解外伤后给予EGF对大鼠神经功能的影响。 结果：脑外伤后，损伤区周围及室管膜下区nstin阳性细胞计数较正常组显 著增加。海马区nestin阳性细胞数较正常组无显著增加。给予EGF后，室 管膜下的nestin阳性细胞计数较外伤未给EGF组显著增加o叼01），而损伤 区周围的nstin阳性细胞计数与外伤组无显著差异o＞0．05卜双重免疫组化 检查显示：所有组中，伤后早期均有BrdU＋nestin＋双重染色细胞，8周后发 现BrdU＋GFAP＋双重染色细胞存在，提示脑外伤后神经干细胞增殖并分化为 胶质细胞；只有在外伤＋EGF组的动物发现有BrdU＋NSE＋双重染色细胞， 提示在EGF作用下，脑内有新生神经元的产生。 虽然给予EGF后能促进成年大鼠脑内新生神经元产生，但爬坡实验、行 走实验、平衡实验等神经行为学检查与外伤未给EGF组无明显差异。提示新 生神经元尚未整合到神经系统中而发挥功能。如何进一步调控神经元的产生 并使新生神经元发挥功能，尚待进一步研究。 结论：1、成年SD大鼠在脑外伤后，神经干细胞能增殖并进行分化，但主要 分化为神经胶质细胞。二、侧脑室内注射EGF能促进大鼠脑外伤后体内神经 干细胞的