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反义血管内皮生长因子基因转染抑制胰腺癌生长的实验研究

邵成浩  
【摘要】:肿瘤的血管新生(Angiogenesis)理论由Judah Folkman于七十年代首先提出,研究表 明血管新生是实体肿瘤生长与转移的基础,肿瘤依赖从新生血管中获取营养和排泄代谢 废物,肿瘤中的微血管数量与几乎所有的实性肿瘤的预后均密切相关。 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种重要的促血管 生成的细胞因子,具有特异性促进血管内皮细胞有丝分裂和强烈的增加毛细血管通透性 的作用。研究发现,VEGF在多种肿瘤中均过度表达,与肿瘤的生长、转移和预后相关。 国内外已有多项研究证实抑制VEGF的表达或阻断其信号传导途径(VEGF抗体、拮抗 VEGF的受体)可以明显地减少肿瘤的血管新生、抑制肿瘤的生长。以VEGF为靶点的 抗肿瘤血管新生治疗是目前研究的热点。 胰腺癌早期诊断率低,手术切除率仅30%左右,肝脏、淋巴结转移率高,对放化疗不 敏感,术后5年生存率不到5%,是预后最差的消化道恶性肿瘤之一。文献报道,所有的 人胰腺癌细胞株均能表达并分泌VEGF,VEGF是胰腺癌血管生成的重要调节因子,其 过度表达与胰腺癌的恶性程度和肝转移密切相关,是一个独立的预后因素。研究发现, 部分胰腺癌细胞和胰腺癌细胞株可以表达VEGF受体,提示VEGF能够以自分泌的方式 促进胰腺癌增殖。阻断VEGF的表达有可能成为治疗胰腺癌的一条新的途径。 本研究采用反义基因在mRNA水平抑制靶基因表达的策略,采用重组腺病毒介导的 反义VEGF_(165)基因转染的方法,以能够分泌VEGF的人胰腺癌细胞株SW1990为研究对 象,分别从体内、体外实验两方面研究反义VEGF_(165);基因转染对SW1990细胞的生物学 特性和血管新生的影响,探讨反义VEGF基因转染在胰腺癌治疗中的意义,为进一步开 展临床应用研究奠定基础。主要研究内容、方法和结果如下: 1.血管内皮生长因子(VEGF)在胰腺癌中的表达及某临床意义 采用免疫组织化学标记,观察58例人胰腺癌组织中的微血管密度(MVD)、VEGF 的蛋白表达及其与肿瘤生物学特性的关系。结果表明,胰腺癌组织中的微血管数量与 VEGF的表达成正比,二者与肿瘤细胞的分化程度和淋巴结转移相关,高VEGF表达患 者预后不良。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了 11例人胰腺癌组织和 第二军田大学博士学位论文 中丈摘要 普通外科专业 两株人胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988的VEGFWA的表达,结果显示,胰腺癌细 胞株SW1990、PaTu。988和胰腺癌组织中VEGFWA表达有VEGF189、VEGF165及 VEGF121三种亚型,VEGF165和VEGF121两个低分子量亚型表达量最高,并且肿瘤组 织比癌旁组织 VEGF rnRNA表达量增高。结果说明,以 VEGF为靶点,阻断其信号传导 途径治疗胰腺癌在理论上是成立的。 2.反义VEGFI。S重组粘幢羹体中)的构羹及反义VEGF重 羹 (Ad栅GF)和级告羹困LacZ丞闪回瞩羹(AddeacZ)的产生 应用基因重组技术,将 sl3bp的人 VEGF16弘DNA反向克隆到 EI区与 E3区缺失的 Ads腺病毒粘粒载体 pAxCAwt的 SWat酶切位点。利用J包装蛋白构建环形粘粒,转化 LE392感受态细菌,收获阳性克隆。用PCR扩增初筛,经SatiN切电泳获得含有目的基 因的亚质粒。将亚质粒感染感受态 TGI细菌所获得的亚质粒克隆用 Ec。R I+BalnHI酶切 鉴定,取VEGFu弘DNA反向插入的pAxCAwt—aVEGF重组粘粒进行扩增,纯化。 应用磷酸钙共沉淀法将经消化的亲本腺病毒末端蛋白复合物(hC)与重组粘粒 pAxCAwtaVEGF共转染293细胞,产生反义VEGF165重组腺病毒,经反复筛选、鉴定、 扩增得第四代反义VEGFles重组腺病毒。同法制备报告基因Lac-Z重组腺病毒。氯化艳 梯度离心获取 10‘、 滴度的重组腺病毒。用 Lac毛重组腺病毒转染 SW1990细胞株, 外源Lac上基因在细胞内表达细菌特有的p-半乳糖昔酶与X仑al染液作用可显示特异的 蓝色。结果表明本研究构建的重组腺病毒载体系统可以成功的转移外源基因并在体外培 养的SW1990细胞中获得有效表达。 3.反义VEGFIo重组回瞩霉对体外增养的SW1990细胞生物学特性的影响 用Lacz重组腺病毒在体外转染SW1990,X—gal染色确定转染效率,100MOI时 SW1990细胞的感染率达100%。据此,以MOI值为100进行重组腺病毒在体外转染 SW1990,MTT方法检测重组腺病毒转染对肿瘤细胞生长的影响。结果表明,Ad.aVEGF、 A小LacZ转染并不影响SW1990细胞的生长速度,流式细胞仪OCM)检测没有发现重 组腺病毒转染后细胞周期出现异常。Northern blot检测转染后 SW1990细胞 VEGFrnRNA 水平,结果提示Ad.aVEGF转染组肿瘤细胞VEGFInRNA水平明显下降,第3、4天达 高峰。ELISA检测转染后肿瘤细胞培养上清中分泌的VEGF蛋白,同样发现转染 Ad.aVEGF 3天后细胞上清中 VEGF开始下降,第 7天后降到最低点。结果说明 AdaVEGF重组腺病毒能够有效地转染SW1990细胞,并通过下调内源性的VEGF表达 3 第二军匠大学博士学位论文 中文摘要


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