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TOLL样受体4(TLR4)基因的克隆及其在介导LPS细胞反应中的机理研究

钟山  
【摘要】: 研究背景 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)即存在于细胞壁外膜中的内毒素 (endotoxin)成分,在革兰阴性菌感染的致病机理中起着十分重要的作用,亦是内 毒素中毒休克发生的主要病因。对LPS介导的毒性反应一直是研究的热点,自80年 代发现人类Toll样受体后,对LPS引起机体损伤的机制逐渐明朗化。最近的研究表 明,LPS引起的免疫反应与Toll样受体有很大的关系,由TLR2和TLR4作为LPS信 号转导受体,通过MyD88蛋白与IL-IR信号转导途径重合,最终导致NF-κB的激 活,引起各种炎症因子基因表达。从C3H/HeJ小鼠获得的TLR4含有一个单氨基酸 突变,导致对LPS的低反应性;而从TLR2缺陷小鼠分离出的巨噬细胞和B细胞对 LPS反应的程度几乎与从野生型小鼠分离出的相同;中国仓鼠细胞(CHO)虽然对 LPS有完全反应性,但它的基因组型编码的是TLR2的无功能基因;U973细胞虽然 缺乏TLR2的表达,但也保留对LPS的反应性。所有这些研究都证明TLR4是LPS 诱导的免疫反应的信号转导受体。 研究目的 本研究从原代培养的人脐静脉内皮细胞中克隆TLR4的细胞外段基因,进行表 达;并将TLR4基因导入不表达TLR4的HL60和人皮肤成纤维细胞,观察LPS对 这两种转染细胞的反应。 研究方法 1、以原代培养的人脐静脉内皮细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增TLR4细胞外 段基因,插入pMD18-T质粒,转化后,阳性克隆送全自动荧光测序。 2、将TLR4细胞外段基因克隆入pET-11a表达载体,获得重组表达的TLR4胞外 区蛋白。 3、将含TLR4全长基因的pCMVSPORT3质粒用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,酶切产 物定向插入pcDNA3.1(+)质粒,转化后,阳性克隆提取质粒,以脂质体法 转染HL60和原代培养的人皮肤成纤维细胞,G418选择培养基筛选阳性细 胞。 4、将转染TLR4基因的细胞用LPS作用,观察TLR4对LPS反应的影响。 研究结果 1、RT-PCR扩增出TLR4胞外区基因并克隆,送全自动荧光测序,与发表文献序 列一致。 中文摘要 一 2、将 TLR4胞外区基因克隆入 PET-118表达载体,重组表达 TLR4胞外区蛋白, 获得分子量为71kDa(SDS-PAGE)的预期蛋白。 3、将TLR4全长基因转染HL60和人皮肤成纤维细胞,获得稳定表达TLR4的 HL60细胞株。 4、TLR4可增强LPS对细胞的一定生长抑制作用,血清因子发挥协同增强作 用。 结论 成功从原代培养的人脐静脉内皮细胞中扩增出TLR4细胞外段基因,证实在LPS 反应中内皮细胞的信号转导途径可能与单核细胞、B细胞一样,是通过TLR介导 的。并将TLR4细胞外段克隆入pET叶 表达载体,获得71kDa的目的蛋白,为后续 研究TLR4胞外区功能打下基础。在稳定表达TLR4的HL60细胞株中,TLR4可增强 LPS对细胞的生长抑制作用,血清因子对TLR4的功能有协同作用。


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