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人白细胞褪黑素受体的鉴定、定位及褪黑素对白细胞的作用机制和意义

陈向芳  
【摘要】: 人白细胞褪黑素受体的鉴定、定位及褪黑素对 白细胞的作用机制和意义 褪黑素(Melatonin,Mel)是生物体内重要的神经内分泌激素之一,过去认为它的作用仅是调节生物体的生理周期性节律。近年来,随着人们对Mel研究的不断深入,逐渐发现它还具有调节生殖系统、免疫系统,抗氧化、抗肿瘤等重要的生理、药理作用。由于这些作用的重要性,加上它所具有的小分子、脂溶性、以及在生物体内广泛存在的特点,深入探讨Mel的生理作用,并阐明其作用机制就有着十分重要的意义。 虽然已经明确了如此多的重要的生理作用,但Mel在生物体内作用的靶细胞、靶器官远未完全明确,这成为对Mel作用机制研究的障碍,因此对Mel作用位点的研究仍是Mel领域的研究重点之一。目前已经有人报道Mel能调节免疫细胞和免疫系统功能,影响免疫细胞的增殖以及相应细胞因子的水平和相关基因的表达,但仍局限于单个或少数几个基因的研究。因此深入探讨Mel对生理和病理状态下的免疫细胞的作用,并阐明其作用机制就显得十分重要。 本研究运用多种实验技术和方法,旨在阐明以下几个问题:1.人外周血淋巴细胞、粒细胞和HUT78细胞是否存在Mel受体,以及其具体类型和细胞内的分布特点;2. 观察Mel对正常人外周血淋巴细胞和HUT78细胞株是否具有促增殖作用,并确立最佳作用时间和作用浓度;3. Mel对病理状态下即2型糖尿病外周血淋巴细胞是否具有抑制其凋亡、促进其增殖反应的作用;4. 应用基因芯片技术研究Mel刺激的T淋巴细胞株(HUT78)是否存在早期反应的免疫相关基因的变化。本研究的最终目的是为研究Mel调节免疫功能的机制提供新的依据。 本研究的主要研究方法和结果: 第一部分:方法:选择健康成年人,于清晨8:00左右抽取外周血,应用密度梯度离心法分离淋巴细胞和粒细胞,HUT78细胞株购自中科院上海生化细胞研究所,分别抽提其总RNA,以mt1和MT2两种引物进行RT-PCR,其产物经电泳,取其阳性条带自动测序仪测序;同时将所分离的淋巴细胞、粒细胞以及HUT78细胞分别制成细胞涂片,干燥、固定,以免疫组化Envision法进行染色。结果: WP=6 人外周血淋巴细胞、粒细胞和HUT78细胞总RNA进行RT-PCR产物电泳显示以mt1为引物的阳性条带(分子量相当于350核苷酸),但均无以MT2为引物的阳性条带(分子量相当于363核苷酸),阳性条带经测序结果表明扩增产物均与人类Mel受体亚型mt1的cDNA相吻合,但均无Mel受体亚型MT2;免疫组织化学染色结果显示,人外周血淋巴细胞、粒细胞和HUT78细胞的细胞膜和细胞浆均可见mt1受体亚型蛋白的阳性反应颗粒(呈棕褐色),而均未见MT2亚型蛋白的表达,与RT-PCR结果相符合。 第二部分:方法:应用MTT法观察不同浓度的Mel分别与人淋巴细胞和HUT78细胞作用不同时间后细胞增殖的情况。 结果表明:单纯应用Mel或低剂量植物血凝素(PHA)对正常人外周血淋巴细胞均无促进增殖作用,而当Mel与PHA联合培养则对淋巴细胞具有促进增殖作用,且在10-9~10-5M时有显著意义(P0.05);但单纯应用Mel已经能有效促进HUT78细胞株的增殖,其作用浓度亦在10-9-10-5M时具有统计学意义(P0.05);Mel在浓度为10-7M、作用时间为24h时,对正常人外周血淋巴细胞和HUT78细胞株的促增殖作用最强,而Mel的促增殖作用可被Mel的受体阻断剂Luzindole逆转。 第三部分:方法:不同浓度的Mel与2型DM患者PBL共同培养,应用MTT法检测Mel对2型DM患者PBL增殖的作用,应用流式细胞仪检测Mel对2型DM患者PBL凋亡的影响,以及应用吖啶噔荧光活体染色从形态学检测细胞凋亡率用于观察Mel对淋巴细胞的影响。 结果 1. MTT法检测结果表明2型DM患者PBL体外培养24h后其细胞增殖能力明显低于正常对照组(P0.01),流式细胞仪检测结果进一步显示DM组凋亡细胞数明显高于对照组(44.93±3.49%比25.43±3.62%,P0.01)。2. Mel对糖尿病组和正常对照组人淋巴细胞均具有促增殖作用,但Mel(10-11~10-5M)对前者的促增殖作用尤为显著,同时能有效抑制2型DM组淋巴细胞的凋亡,且Mel浓度在10-7M作用最为显著。3. 吖啶噔荧光活体染色结果提示DM组PBL可见具有典型凋亡形态的细胞(凋亡率:25.02±11.28%):凋亡早期的细胞染色体浓缩并向核周边聚集,在核周边呈环状或颗粒状荧光;凋亡中期的细胞染色体浓缩,细胞核呈斑点状荧光,细胞膜呈泡状改变;晚期凋亡的细胞体积缩小,核高度浓缩,镜下即见高度荧光强度的小细胞或凋亡小体。而正常对照组(凋亡率:16.72±8.07%)和Mel干预的DM组 WP=7 (凋亡率:18.01±7.30%)则均较少观察到上述典型的细胞凋亡形态。 第四部分:方法:以包含408条人类免疫相关基因的DNA表达谱芯片检测人T淋巴细胞株HUT78细胞受免疫调节剂Mel刺激24h后早期的基因表达谱的变化,分别抽提Mel干预组与对照组的细胞总RNA并逆转录成cDNA,掺入荧光标记,同时与芯片杂交,通过扫描分析每一位置的荧光信息得到二者间基因表达的差异信息,从中筛查出早期反应差异表达基因。结果:T淋巴细胞株受Mel作用24h后,共筛选出112条基因表达差异,其中105条基因上调,7条基因下调。 结论:1.人外周血淋巴细胞、粒细胞以及HUT78细胞株中均存在mt1受体蛋白,同时检?


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