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白血病细胞多药耐药基因表达谱变化及其逆转策略的研究

陈莉  
【摘要】: 目的和意义 建立bcr-abl阳性多药耐药白血病细胞系,比较耐药前后其生物学特性差异;通过基因芯片技术检测耐药前后基因表达谱变化,探讨耐药分子机制;研究环孢菌素A、他莫西芬及α-干扰素逆转耐药的作用,通过比较其单独应用和联合应用对bcr-abl和mdr1共同阳性白血病细胞的作用探寻白血病治疗新方法。 STI571是目前最有效的酪氨酸蛋白激酶抑制剂,研究bcr-abl阳性多药耐药白血病细胞是否对STI571也耐药;STI571分别与长春新碱、柔红霉素、柔红霉素+阿糖胞苷等联合应用,对抑制bcr-abl 和mdr1共同阳性的白血病细胞的增殖是否有协同作用,为临床治疗提供新思路。 对初发急性白血病患者开展约12000余个基因表达谱的研究,对急性白血病的发病机理、诊断分型及预后判断提出新观点,以便更好地指导临床治疗。 方法 采用长期、间歇、单一、小剂量给药的方法诱导裸鼠高致瘤性K562-n细胞成为多药耐药细胞系(K562-n/VCR),采用细胞培养技术比较K562-n和K562-n/VCR细胞系的细胞生长曲线、软琼脂培养集落形成率、细胞周期分布、对其他化疗药物的敏感性,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测柔红霉素在细胞内积聚量, RT-PCR方法验证bcr-abl基因、mdr1基因表达,免疫组化方法检测细胞P-gp表达,体内接种比较裸鼠体内致瘤性,染色体核型分析观察与耐药相关的染色体变化,以及基因芯片研究基因表达谱的差异,探索MDR阳性K562-n/VCR细胞系细胞生物学特性及耐药的分子机制;四氮甲基唑蓝(MTT)法研究环孢菌素A、他莫西芬及α-干扰素逆转耐药的作用,通过比较其单独和联合应用对bcr-abl、mdr1共同阳性白血病细胞的作用,探讨逆转其耐药的方法,为今后进一步研究耐药机制及新的逆转方法奠定基础。 WP=5 用四氮甲基唑蓝(MTT)法检测bcr-abl和mdr1共同阳性白血病细胞对STI571是否交叉耐药,环孢菌素A、他莫西芬及α-干扰素对耐药的逆转作用;检测STI571与长春新碱、柔红霉素、柔红霉素+阿糖胞苷等联合应用对bcr-abl和mdr1共同阳性白血病细胞是否有协同抑制作用,为白血病临床治疗提供新思路。 利用DNA芯片技术对22例初发急性白血病患者,包括6例难治性急性白血病及16例非难治性急性白血病患者开展包括12000余个基因的表达谱研究,通过对这些差异表达的基因进行聚类分析,进一步研究急性白血病发病机理,寻找诊断分型、预后判断及治疗等方面的新方法。 结果 采用长期、间歇、单一、小剂量给予长春新碱的方法诱导裸鼠高致瘤性K562-n细胞成为多药耐药细胞系K562-n/VCR, K562-n/VCR与亲本细胞系K562-n比较,细胞生长曲线及倍增时间无明显差异;软琼脂培养集落形成率及大集落形成率差异不显著。超微结构观察两种细胞均核浆比例较大,核畸形、分叶显著,核仁清楚,2-3个,甚至更多,核膜不规则,有折叠凹陷,常染色质增多,异染色质少见, K562-n/VCR细胞胞浆内线粒体肿胀、堆积,有较多空泡,游离核糖体增多,其余细胞器较少,微丝、中间丝增多,排列紊乱。细胞周期分析K562-n/VCR细胞S期比例增高。K562-n/VCR细胞除对原诱导药物具有耐受性外,对其他多种抗肿瘤药物如柔红霉素、高三尖杉酯碱、米托蒽醌、足叶乙甙等也具有交叉耐药,即表现多药耐药性,流式细胞仪检测细胞内柔红霉素含量K562-n/VCR细胞平均荧光值为41.3,明显低于K562-n细胞的185.44。RT-PCR检测K562-n、K562-n/VCR两株细胞bcr-abl融合基因均为阳性,K562-n细胞mdr1基因阴性,K562-n/VCR细胞mdr1基因阳性;免疫组化法检测P-gp K562-n细胞为阴性而K562-n/VCR细胞为阳性。K562-n、K562-n/VCR细胞裸鼠体内致瘤率相同,均为100%,5×106细胞接种裸鼠30天后肿瘤体积K562-n/VCR细胞为10.09±2.34cm3,K562-n细胞为4.05±0.40cm3,两者差异显著(P<0.05),K562-n/VCR细胞致瘤潜伏期为8±0.33天,较K562-n细胞的潜伏期10±0.33天明显缩短(P<0.05)。染色体核型分析:K562-n细胞染色体数目为61-64, WP=6 干系为亚三倍体,染色体众数63±0.99;K562-n/VCR细胞染色体数目为54-65,干系为亚三倍体,染色体众数63±0.82;染色体核型分析表明,K562-n、K562-n/VCR两株细胞发现两个相关克隆,两株细胞均未见典型Ph染色体,均未发现与多药耐药相关的特异的染色体核型变化。 基因芯片分析K562-n、K562-n/VCR细胞基因表达差异的结果显示,在12800条基因中,K562-n/VCR和K562-n细胞在三次实验中均有差异表达的基因有58 条,与K562-n细胞比较,K562-n/VCR细胞表达上调的有57条,表达下调的有1条。上调的基因包括耐药相关基因,细胞周期蛋白,转录因子及信号转导基因,代谢相关基因,细胞骨架基因,凋亡相关基因,转录后加工基因,热休克蛋白,癌基因。表达下调的1个为转录激活因子。这些基因中37条为已知基因。 环孢菌素A、他莫西芬及α-干扰素分别对K562-n/VCR细胞的多药耐药有不同程度的逆转作用,流式细胞仪检测加用不同逆转剂后细胞内柔红霉素含量变化发现仅环孢菌素A能使细胞内柔红霉素含量增加但未能达到耐药前水平;逆转剂联合应用对bcr-abl和mdr1共同阳性白血病细胞的耐药逆转作用比其单独应用更强。 bcr-abl和m


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