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乙型肝炎病毒基因分析及其与抗病毒疗效关系的研究

张瑞祺  
【摘要】: 本研究分三个部分:一、HBV基因YMDD基序直接测序法的建立及其临床应用;二、一种新的基于pre-s/s区的乙型肝炎病毒限制性片段长度多态性基因型分型方法的建立和应用;三、膦甲酸钠治疗慢性乙型肝炎47例临床疗效观察。 一、HBV基因YMDD基序直接测序法的建立及其临床应用 目的 提高乙型肝炎病毒(HBV)DNA P基因区聚合酶链反应(PCR)检测的阳性率;探讨HBV YMDD基序变异的临床意义。方法 采用优化PCR反应条件、选择引物、降低退火温度以及应用3’末端碱基游移简并引物,减少引物与模板引物结合区的错配对PCR的影响等多种方法,对常规PCR检测HBV DNA P基因区阴性的病人血清再行PCR。对16例从未进行抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者进行YMDD变异的检测,并对22例使用拉米夫定后经直接测序法证实有变异患者进行了HBV DNA定量检测和肝功能的测定。结果 应用上述方法能显著提高HBV DNA P基因区PCR检测的阳性率。16例未进行抗病毒治疗者均未发现YMDD变异。使用拉米夫定患者22例YMDD基序者中,7例发生YVDD变异,15例发生YIDD变异。使用拉米夫定过程中发生YMDD变异的患者中,7例出现肝功能恶化,占31.8%,其中1例出现严重肝功能失代偿,其余15例患者肝功能未发生明显恶化。出现YIDD变异者中40.0%患者出现肝功能恶化,YVDD变异者中14.3%患者出现肝功能恶化。所有发生YMDD变异患者HBV DNA均发生反跳,其中YIDD变异者中DNA水平较高者占70.0%,YVDD变异者中DNA水平较高者占25.0%。结论 应综合采用多种方法以提高基因高突变区PCR检测阳性率;患者在使用拉米夫定前无HBV YMDD基序变异;患者使用拉米夫定过程中可发生YMDD变异,并可引起肝功能恶化和HBV DNA水平反跳。 二、一种新的基于pre-s/s区的乙型肝炎病毒限制性片段长度多态性基因型分型方法的建立和应用 摘 要 目的 建立一种新的乙型肝炎病毒基因型分型方法。方法 用LaserGene 99 工具包筛选合适的限制性内切酶,分析**m中所登录的132株己注明基因型 的HBV全序列前S区的限制性内切酶位点,建立聚合酶链式反应-限制性片段 长度多态性oCR-yLP)基因分型方法,并以此分析上海地区30例慢性乙型肝 炎病人的病毒基因型,PCR产物经直接测序法对其分型结果进行验证。结果 测 序结果证实这一新的PCR-RFLP基因分型方法准确有效。在上海地区的慢性乙 型肝炎患者中,B型10.0O,C型83.3O,B、C混合型感染6.7O。结论 这一 新的病毒基因型分型方法操作简便,结果可靠,费用低廉,适用于基层单位开 展和大范围的流行病学调查;上海地区的慢性乙型肝炎患者中以C基因型感染 最为常见。 l关键词]乙型肝炎病毒,基因型,yLP,厂res/s基因 三、磷甲酸钠治疗慢性乙型肝炎47例临床疗效观察 目的 观察磷甲酸钠治疗慢性乙型肝炎的疗效及毒副反应,并观察磷甲酸 钠对不同基因型慢性乙肝患者的疗效。方法 选择漫性乙型肝炎患者47例, 在常规保肝治疗的基础上加用磷甲酸钠;对照组20例仅给予常规保肝治疗。治 疗前、中、后观察患者的临床症状、体征、肝肾功能、电解质、细胞及体液免 疫指标、乙肝病毒兔疫学指标、HBV DNA含量等的变化,并采用PCR扩增后 产物限制性片段长度多忐性(PC-yLP)分析法进行HBV基因分型,PCR产物 直接测序法对其分型结果进行验证,探讨基因分型对磷甲酸钠抗病毒疗效的影 响。同时分析鳞甲酸钠对 HBV YMDD变异株的治疗作用。结果 治疗组中 45 例患者肝功能有一定程度的恢复,9例慢重肝患者中6例存活;对照组4例慢 重肝患者中 2例存活。治疗组中 42例 DNA水平下降,以第一周明显,HBV DNA 定量由(1883二4土1774.85)pg/ffil降为(689.50土1111.05)pg/ml,13例 患者DNA转阴。30例HBeAg阳性患者中,二例出现血清转换,l例转为弱阳 性。对照组中 13例 DNA水平上升,7例下降,HBV DNA定量由(ZI 06.86 t 1739.31)pg/ml升为(2 362.34土1917.98)pg/ml,1例 DNA转阴;11例 HBeAg 阳性患者中1例出现血清转换。治疗组中34例患者进行细胞免疫学指标检查, 用药后23例CD4活性增加,活性由(39,20土6.92)%上升为(42.39土7.98)%; 4 MQ 22例CDS活性降低,活性由(32.37土8刀6)%降为(30.38土8.50)%;20例NK 活性降低,活性由(


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