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两个先天性凝血因子V缺陷症家系的临床和分子发病机制研究

傅卫军  
【摘要】: 研究背景:凝血因子Ⅴ(FⅤ)是一种分子量为330KD的单链糖蛋白,对凝血和抗凝平衡的维持具有重要的作用。它是由3个同源的A区、2个同源的C区及1个高度糖基化的B区连接而成,顺序如下:A1-A2-B-A3-C1-C2。重链由A1和A2区段组成,轻链则包含A3区、C1区和C2区。近年来,人们已完全解码了FⅤ基因的全长序列(GenBank 序列号Z99572),它定位于染色体1q23,跨度达80Kb以上,有25个外显子。FⅤ mRNA编码28个氨基酸的前导肽和2196个氨基酸的成熟蛋白质。其中1到12号外显子、14到25号外显子及13号外显子分别负责编码FⅤ分子的重链、轻链和B区。先天性凝血因子Ⅴ缺陷症即副血友病,由Owren于1947年率先报导,是一种少见的常染色体隐性遗传性出血性疾病。其估计的发病率为1/1000000。先天性FⅤ缺陷症的临床表现差异很大,一般仅纯合子有出血表现,杂合子通常无出血症状。随着对FⅤ分子基础研究的深入,使人们有可能在分子水平对先天性V因子缺陷症进行研究,并发现了数种FⅤ基因的突变类型。这些分子发病机制的阐明将有助于进一步剖析先天性因子V缺陷症临床表现的差异,并为最终治愈这种疾病奠定基础。 目的:介绍两例先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的诊断过程和治疗结果,观察先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的遗传规律,探讨在较重大手术时的围手术期处理方案;研究两例先天性凝血因子Ⅴ缺陷症先证者的分子发病机制,并在家系研究中进一步进行证实。同时,明确所发现的异常FⅤ基因是否为正常人群中的多态性。 实验方法: PT(凝血酶原时间)、 APTT (活化部分凝血活酶时间)、TT (凝血酶时间)及凝血因子活性检测采用DADE Bchring公司试剂盒,于CA-1500全自动凝血测定仪上进行。FⅤ抑制物检测参照Bethesda法。并对两例先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的家系进行了调查。通过输注新鲜冻干血浆,对其中一例患者的硬膜外血肿进行了清除。 按GenBank已发表的DNA序列(Z99572),设计合成扩增FⅤ基因25个外显子的特异性引物(引物位于各内含子区,以确保能扩增出FⅤ基因的剪接位WP=4点)。用DNAZOL分离外周血单个核细胞基因组DNA,并进行PCR。PCR产物经胶回收纯化试剂盒纯化后,于ABI 377 DNA测序仪上直接测序或T-A克隆后再行测序(13号外显子)。测序结果与GeneBank已知的DNA序列比较,对比正反向测序和不同次PCR产物的测序结果,明确FⅤ基因的突变位点。用限制性内切酶证实变的FⅤ基因在患者家系成员中的分布情况,并在正常对照人群中进行了多态性分析。 实验结果: 两例患者确诊为先天性V因子缺陷症(纯合子)。患者A父母、患者B的母亲和儿子均为先天性V因子缺陷症杂合子型。从两位患者的家系的初步调查结果分析,也表明符合常染色体隐性遗传规律。患者A经新鲜冻干血浆替代治疗后,成功进行了硬膜外血肿清除术。 通过对两个有明显出血表现的先天性因子V缺陷症家系的初步研究,鉴定到两个新的FV基因突变类型:患者A的第8号内含子3'端剪接位点存在A→G的纯合子突变;患者B在第18号外显子相当于mRNA(M16967)5729位置上存在C→A 的纯合子突变,相应的氨基酸变异为Pro1880Gln。它们在家系研究中已被进一步证实。我们所鉴定到两个新的FV突变基因,经文献检索未见类似报道。鉴于先期研究证实的所有FV变异均集中于外显子编码区,因此位于内含子剪接区的FⅤ基因突变的发现,首次证实了先天性凝血因子V缺陷症的另一种新的分子发病模式。 我们还发现FV基因外显子2在327A→G,Gln79、外显子8在1332A→G,Lys414,它们均为沉默突变(M16967);在第16号外显子编码区下游+12nt的位置上(第17号内含子)A→G的突变是一种多态性。另外,也证实了先期的研究,即外显子16编码区5380 C→T(M16967),导致的His1764Tyr;在第17号外显子编码区上游-6~-5 nt、-9~-8 nt、-26~-25 nt的位置上 (第16号内含子)分别发生Insertion CT、 Insertion T 和Insertion T也是一种多态性。 结论:两个新的FⅤ基因变异与先天性V因子缺陷症的发病有关。


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