胎鼠脑神经干细胞鉴定纯化与生物学特性观察

【摘要】： 神经干细胞概念的确立，对既往50年中有关神经系统的发育和神经再生的设想给予了充分的肯定。同时，随着对神经干细胞的生物学特性和体外、在体研究结果的不断丰富与充实，研究者对神经干细胞可能给临床神经科学带来充满希望的应用前景寄予厚望。以体外诱导分化的神经干细胞移植实现组织学和功能治疗脑损伤和衰变后产生的神经功能障碍的重建和康复；以神经干细胞或神经前体细胞为载体实现对特异性基因的脑内导入，从而达到治疗恶性肿瘤或提供特殊神经营养物质及神经递质的目的，成为神经干细胞临床应用研究的焦点。这些工作开展的前提是首先完成神经干细胞的鉴定检测与纯化富集，并完成神经干细胞的体外扩增，通过体外培养观察神经干细胞的生物学活性。 我们在上海市科委、上海市卫生局基金的支持下开展神经干细胞的系列研究，主要开展了以下几方面的工作： 1．检测神经上皮干细胞蛋白在神经干细胞膜上的分布。 目的：判明神经上皮干细胞蛋白在胎鼠脑神经干细胞膜中的存在。 方法：实验中采用取孕16-18天胚胎大鼠脑组织，组织匀浆后以超速离心提取脑细胞质膜蛋白，获得胎脑神经细胞总膜蛋白的浓度：6.23mg/ml，经SDS-PAGE垂直电泳，转移电泳产物至硝酸纤维素膜（NC）膜，电转移后丽春红染色可以见蛋白样品及标准分子量参照蛋白均有效转至NC膜上， WP=7 western blot检测。 结果：于240kda和220kda处可以清晰辨别两条神经上皮干细胞蛋白（neuroepithial stem cell protein, nestin）组化染色阳性条带。 结论：实验证明细胞膜中存在神经干细胞特异性的nestin蛋白。这一结果表明：(1)在胎鼠脑神经细胞膜蛋白样品中，存在nestin蛋白，根据目前对胚胎动物脑内存在神经干细胞以及nestin蛋白是神经系统干细胞特异性表达的抗原产物的认识，可以推断，这些nestin来自胎脑细胞中含有的神经干细胞细胞膜中；(2)与单克隆抗体发生特异性反应的蛋白表现为不同的分子量，这可能是在细胞膜nestin中，部分发生糖基化，从而改变了蛋白的表观分子量；(3)nestin定位于神经干细胞膜的发现，为神经干细胞研究方法的拓展，包括利用流式细胞技术检测膜表面蛋白阳性的神经干细胞和利用磁性细胞分离技术分离膜表面蛋白阳性的神经干细胞提供了实验依据；（4）nestin 部分分布在细胞膜中，提示nestin蛋白可能参与细胞间信号传导，并且在维持干细胞特性方面具有独特的作用。 2．以流式细胞技术检测nestin阳性神经干细胞。 目的：标记膜分布nestin抗原，以流式细胞检测，胎鼠及成年大鼠脑内不同脑区nestin 阳性神经干细胞比值。 方法：采取胎鼠及成年大鼠大脑皮质与皮质下脑组织大脑皮质及皮质下组织。吸管吹打，制成单细胞悬液（1x106/ml）， Q－PREP仪（Coulter公司）直接处理溶解红细胞，细胞悬液0.5毫升，加nestin单抗0.5μg，并设同型对照，冰浴45min， PBS洗涤，加羊抗小鼠Ig-PE，冰浴45min，洗涤重悬于PBS中。用流式细胞仪及其配套软件进行取数和分析。 结果：胎鼠全大脑组织及大脑皮质、皮质下组织中均可检出nestin 阳性细胞，皮质下组织中阳性细胞比值显著高于全大脑组织中阳性细胞比值，P0 .05。胎鼠皮质组织与皮质下组织、皮质与全大脑组织相比无统计学差 WP=8 异。胎鼠脑组织各部位阳性细胞比值均显著高于成年大鼠各脑区阳性细胞比值，P0.01。成年大鼠大脑皮质下组织阳性细胞比值明显高于皮质组织，P0.01。各组样本与其同型对照相比较，除成年大鼠脑皮质组织与对照结果无差异（P0.05）外，其余均有显著差异（P0.01）。 结论：⑴孕龄16～18d之胎鼠脑组织中，大脑皮质及皮质下区均存在nestin阳性细胞，提示神经干细胞参与神经系统组织结构的形成与分化过程；⑵胎鼠大脑皮质下区域中nestin阳性细胞比值达35.4%，提示在脑室附近区域中，具分化潜能的神经前体细胞分布较多，可能是神经发育潜在的发源地；⑶成年大鼠大脑皮质区域netin阳性细胞未能检出，而脑室附近区域nestin 阳性细胞量可达5.2％。提示成年脑内同样具备神经再生的组织学基础。（4）以流式细胞术检测神经干细胞特异性抗原，方法迅速、简便，结果可靠。 3．体外分选纯化胎鼠神经干细胞。 目的：建立体外分选纯化胎鼠脑神经干细胞的方法。 方法：剖腹取得胎鼠显微手术放大镜下取全大脑组织，制成单细胞悬液（1×106/ml）， 洗涤磁珠，MACS磁珠分离器处理磁珠，弃去上清以去除游离之抗体，每管细胞样本加入nestin 单克隆抗体3μg，冰浴孵育30分钟，PBS洗涤后，与二抗包被的磁珠混匀结合进行反应。室温下孵育30分钟，上磁珠分离器10分钟后，弃去上清，PBS洗涤结合有磁珠的靶细胞2次，制得待测样本，上流式细胞仪检测细胞纯度，检测后以台盼蓝染色检查细胞活性。 结果：神经干细胞的纯化富集间接阳性选择标本经流式细胞检测，阳性细胞纯度为百分比为93％-99.7％，平均为96%±3.1%。台盼蓝检测细胞活性为92%-97%，说明收获得到的细胞具有体外活性。 结论：（1）采用利用膜表面抗原进行细胞纯化的免疫磁性细胞分离方 WP=9 法对神经干细胞进行分离纯化和富集，该方法的特点是分离速度快而简便，磁珠体积小而且