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人源M2三联体靶抗原的克隆表达及其在原发性胆汁性肝硬化中的应用

姜小华  
【摘要】: 原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary crrhosis,PBC)是一种自身免疫机制所导致的慢性进行性胆汁淤积性肝脏疾病,好发于中年妇女。有研究表明,近年来PBC的患病率正显著增加。PBC并无特异性临床症状,多数患者仅表现为不明原因的肝功能异常,病程持续数年,甚至数十年,最后进展为肝硬化。 高滴度的抗线粒体抗体(AMA)是PBC的重要血清学指标。根据靶抗原的不同,AMA可被分为M1~M9共9个亚型,其中只有M2为PBC特异性抗体。PBC病人在出现临床症状和组织学特征变化之前几年甚至十几年就出现了M2抗体。 M2抗体的靶抗原主要为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复合体〔2-OADC〕的一些组分:侧链二氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADC-E2)、丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2(OGDC-E2)。M2抗体识别的BCOADC-E2、PDC-E2和OGDC-E2抗原表位位于硫辛酰区。抗PDC-E2抗体在PBC病人血清中的阳性率为95%。抗BCOADC-E2抗体与抗OGDC-E2抗体的阳性率分别为53%~55%、39%~88%。三抗原联合检测,其阳性率可达92%~100%,而且特异性也很高,尚未有M2抗体在其他疾病检出的报道。 本研究设计克隆表达了一抗原蛋白三联体,命名为BPO,它包含了M2抗体识别的人源BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2的抗原表位片断。我们利用纯化的重组BPO,建立PBC特异性免疫学诊断方法,并应用于临床检测,探讨M2抗体检测在PBC的早期发现与临床诊断中的应用价值。 本研究工作共分三个部分: 一、PBC特异性M2抗体靶抗原及其三联体的克隆表达与鉴定 从人外周血单个核细胞(PBMC)中抽提细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以此作为模板,经PCR法扩增PDC-E2内侧硫辛酰区和部分外侧硫辛酰区, WP=6 BCOADC-E2和OGDC-E2的硫辛酰区。扩增产物用相应限制性内切酶酶切后纯化,定向克隆入表达载体pQE-30。对插入载体的目的基因进行测序,结果与已报道的序列完全一致。将重组质粒pQE-30/BCOADC-E2、pQE-30/PDC-E2、pQE-30/OGDC-E2和pQE-30/BPO转化大肠杆菌M15株(pREP4),异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导重组抗原表达,SDS-PAGE电泳、Western-Blot法和中和吸附试验鉴定表达产物。 15% SDS-PAGE电泳证实:重组蛋白分别在14kD (BCOADC-E2)、18kD (PDC-E2)、10kD (OGDC-E2)和42kD (BPO)分子量处有一条明显的额外蛋白带。 采用7例M2抗体阳性血清鉴定重组蛋白的抗原性。这些血清均经德国Euroimmun研究中心以牛心肌线粒体纯化蛋白,采用Western-blot法测定证实。7例M2阳性的血清中,抗BCOADC-E2抗体、抗PDC-E2抗体、抗OGDC-E2抗体单独阳性的各一例,抗BCOADC-E2抗体、抗PDC-E2抗体同时阳性的3例,抗PDC-E2抗体、抗OGDC-E2抗体同时阳性的1例。以上血清均能与BPO反应。M2阳性的病人血清与表达BPO的全菌裂解液混匀过夜后,Western-blot法测定M2抗体为阴性。这些结果表明:BPO包含有M2抗体识别的BCOADC-E2、PDC-E2和OGDC-E2的主要抗原表位。 二、PBC免疫学诊断方法的建立 我们将N端融合有六个组氨酸残基的重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱,在变性条件下进行纯化,然后透析除去变性剂,以使重组蛋白复性。 利用纯化得到的BPO,建立了Westen-blot法与ELISA法。ELISA法的的批内、批间变异系数均小于10%。 85例阴性对照血清的OD值为 0.073±0.046。阳性临界值定为0.303(阴性平均OD值+5SD)。 三、PBC免疫学诊断方法的临床应用 ELISA 法检测体检者、肝病患者和自身免疫性疾病患者血清中的M2抗体。M2抗体阳性血清用Westen-blot法予以确认。 20例临床诊断为PBC的患者,M2抗体均为阳性,检出率为100%。 6例不明原因肝病患者与1 例临床诊断为药物性肝损患者,M2抗体阳性,他们均符合美国肝脏病学会(AASLD)提出的原发性胆汁性肝硬化诊断指南。1例为临床诊断自身免疫性胆管炎患者和1例自身免疫肝炎患者,M2抗 WP=7 体也为阳性。 873例28周岁以上体检者中有2例(0.23%)检出M2抗体。她们均为40周岁以上女性。其中1名体检者碱性磷酸酶、γ-谷氨酸转肽酶增高,符合AASLD诊断指南。


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