收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

hTERT启动子调控的增殖型腺病毒携带内皮抑素基因治疗胃癌的实验研究

聂明明  
【摘要】: 胃癌是我国常见的恶性肿瘤,虽然近年来治愈率有所提高,但国内5年生存率仍在20%~30%之间。随着分子生物学迅速发展,肿瘤基因治疗正逐步从实验室进入临床,但是进展十分缓慢,其主要障碍是传统基因治疗采用非增殖病毒或物理化学方法等基因传输方案,基因转染率、表达量低,载体对肿瘤细胞缺乏靶向性,从而达不到有效治愈肿瘤的目的。腺病毒载体具有感染效率和外源基因表达水平高、高滴度重组病毒的制备比较简单、适合转载大多数容量较大外源基因等特点而被广泛应用于基因治疗和临床试验。然而大多数腺病毒载体尚存在外源基因表达时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等缺点。肿瘤特异性增殖型腺病毒克服了上述腺病毒载体的不足,能够靶向肿瘤细胞增殖。且病毒本身可杀死肿瘤细胞,而不损害正常细胞,从肿瘤细胞释放出来的病毒可继续感染周围的肿瘤细胞,具有疗效的放大作用。这种新的肿瘤治疗方法称作肿瘤的病毒治疗,与传统治疗方法机制完全不同,一般不引起严重的毒副作用,无限毒剂量。其中增殖型腺病毒ONYX-015被认为是至今最为有效的肿瘤生物治疗方案。如果以增殖型腺病毒为载体携带外源治疗基因,那么目的基因的拷贝可随着病毒的增殖而扩增,在肿瘤组织中高效表达。我们将肿瘤病毒治疗和基因治疗相结合的方法称为基因—病毒治疗。 增殖型腺病毒肿瘤靶向机制的改造有多种方法,本研究采用了人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子作为调控腺病毒靶向增殖的机制。端粒酶被认为是目前发现的最广谱的肿瘤分子标记,与肿瘤无限增殖的特性有关。在胃癌中的端粒酶阳性率达85%~92%,而在绝大多数的正常细胞中无端粒酶活性。hTERT是调节端粒酶活性的主要亚单位,hTERT启动子只有在端粒酶阳性的细胞中有转录活性。因此,hTERT启动子调控的腺病毒具有特异性靶向肿瘤能力。 实体肿瘤的另一个重要特性是通过新生血管生成满足肿瘤所需的丰富血供。自从肿瘤新生血管生成(Angiogenesis)假说被证实以后,抗肿瘤新生血管生成逐渐成为肿瘤治疗策略之一,目前已经有数十种新生血管抑制剂进入临床试验,其中内皮抑素(endostatin)以其强效、无毒、无免疫原性、无耐药性等优点备受关注。 本实验将小鼠的全长内皮抑素(mEndo)基因克隆入hTERT启动子调控的增殖 第二军医大学 中文摘妄 博卜论文 型腺病毒,通过体外试验和治疗荷人胃癌裸鼠,对hTERT启动子调控的增殖型腺 病毒的抗肿瘤机制作初步探讨,为胃癌的基因一病毒治疗、抗新生血管生成基因治 疗及针对端粒酶为靶点的治疗策略提供新的思路。 1、重组携带mEndo基因肿瘤特异性增殖型腺病毒载体的构建及制备 pCAG166-mEndo和 pCAG166-GFP构建:PCR方法从pBlastmEndostatin中获 取 mEndo基因片段,通过重叠 PCR方法在 mEndo基因片段的 5’端引入 M-成瘤 蛋白的信号肽,再用 EcoRI+BamHI酶切,回收 645hp 目的片段与 pUC用 HoRI+BamHI双酶切后缺失3964 载体片段连接。再经EcoRI+BamHI双酶切 鉴定及DNA测序正确后,将口收含有mEndo基因的目的片段与非增殖腺病毒载体 质粒pCA13用厂coRI+BamAI双酶切后缺失764788hp区域的载体片段连接,构建 成 pCA13-mEndo质粒。酶切鉴定正确后,Bglll进行酶切,得到的 1080hp片段中 含有CMV启动子+mEndostatin基因,SV40polyA加尾信号。再将该片段插入到含 hTERT启动子质粒 pCAG166的 Bglll酶切位点,构建成 pCAG166-mEndo,PCR鉴 定正确。用相同方5去从pUC-GFP构建pCAG166-GFP。 * *ZO载体的构建:用引物丁1:5’C*G**T**A**C**C**C*CT**T GTC GAC TCG AGG TTT AAA T3’和 PZ:3AA GCT TCG CCG GCG TGA TCA CAG CTG AGC TCT AAA TTT A GGCCS’)末成连接头,插入pXC10 的A邯I酶切位点, 构建成pXC20。酶切和DNA测序鉴定正确。 pXC20-mEndO及pXC20-GFP的构建:pCAG166-ndlldo应用内切酶NOtl 和hOI 双酶切得1483bpDNA片段,插入内切酶八伙和WOI双酶切后的pXC20载体片段, 构建pXC20-InEndo。经多种方法酶切和PCR鉴定正确。相同方法构建pXC20-GFP。 病毒重组:将质粒pXC20-mEndo、pXC20-GFP及pCA13-mEndo与5含有型 腺病毒右臂的质粒pBGHE3(包含除了5型腺病毒188刁 以外的整个5型腺病 毒基因)共转染至293细胞,9刁4天后出现病毒空斑,经过H次病毒空斑纯化,腺 病毒DNA经KR进行鉴定正确,腺病毒命名为CNHK300-mE、CNHK300-GFP 及AdlnE。病毒在293细胞中反复扩增到需要量,通过氯化艳梯度离心法纯化。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张罗生;何本夫;高兴旺;魏丽霞;闵娜;罗显荣;;重组人内皮抑素腺病毒对裸鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用[J];南方医科大学学报;2010年04期
2 吴扬,杨莉,赵霞,宿静梅,胡兵,刘继彦,牛挺,罗彦,李秋,魏于全;重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究[J];中华医学遗传学杂志;2004年06期
3 周雪瑞;黄选东;苏长青;潘正军;蒋功成;张晓雨;;增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素基因抗乳腺癌的实验[J];肿瘤防治研究;2006年12期
4 姜明红,聂明明,方国恩,崔贞福,吴红平,李琳芳,吴孟超,钱其军;腺病毒介导的小鼠内皮抑素治疗胃癌的研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2004年01期
5 尹嘉;袁绍纪;张荣伟;卢培刚;骆纯;楼美清;卢亦成;;内皮抑素基因在其治疗的G422小鼠胶质母细胞瘤中的表达[J];中国临床神经外科杂志;2007年05期
6 陈洁平,徐采朴,林晨,张雪艳,付明,邓友平,程金科,吴旻;重组RA538腺病毒对人胃癌细胞的体内及体外分子治疗研究[J];第三军医大学学报;1999年05期
7 张子祥,李德春,赵华,朱新国;携带内皮抑素复制缺陷型腺病毒载体的构建及其应用[J];江苏医药;2005年01期
8 尹嘉;袁绍纪;张荣伟;卢培刚;骆纯;楼美清;卢亦成;;转染内皮抑素基因对血管内皮细胞增殖的影响[J];医学综述;2007年23期
9 蒋红亮;武秀华;刘国锋;;基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素对血管内皮细胞的影响[J];交通医学;2010年04期
10 阴忆青,齐荣,邹卫国,秦新裕,刘新垣;细菌内同源重组构建含人内皮抑素基因腺病毒及在胃癌细胞中的体外转染实验[J];中国临床医学;2003年02期
11 陈纲;李世拥;;内皮抑素基因治疗在结直肠癌中的应用[J];腹部外科;2009年03期
12 黄焱;徐国兴;;内皮抑素与眼内新生血管[J];国际眼科纵览;2006年03期
13 廖加群;苏晓庆;彭星辰;石华山;张海龙;杨莉;;重组内皮抑素腺病毒联合卡铂抗小鼠肺癌的实验研究[J];四川大学学报(医学版);2010年03期
14 韩毅敏;王晶;隋丽华;娄阁;王玲弟;;携带内皮抑素基因的腺病毒对HO-8910细胞裸鼠移植瘤的影响[J];中国肿瘤;2011年09期
15 张子祥,李德春,赵华,朱兴国;内皮抑素重组腺病毒载体的构建及制备[J];苏州大学学报(医学版);2004年05期
16 陈钢;易继林;;内皮抑素在肝癌基因治疗中的应用及其进展[J];肝胆外科杂志;2006年02期
17 马颖;何援利;;重组腺病毒Ad-Endo对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响[J];实用医学杂志;2010年21期
18 张子祥;李德春;赵华;朱东明;;腹腔注射内皮抑素腺病毒治疗原位胰腺癌的实验研究[J];苏州大学学报(医学版);2009年01期
19 刘锐;;蔡善君;;内皮抑素抑制脉络膜新生血管基因治疗的研究进展[J];四川医学;2008年06期
20 刘新垣;;癌症的靶向基因——病毒治疗研究进展[J];中国健康月刊;2007年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 尹嘉;楼美请;陈左权;陈先震;;局部注射内皮抑素基因重组腺病毒治疗G422小鼠胶质母细胞皮下荷瘤的实验研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年
2 刘军叶;郭鹞;郭国祯;;腺病毒载体介导的肿瘤乏氧靶向性基因治疗[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
3 王安训;黄洪章;;腺病毒介导CD/5-FC系统治疗舌癌的实验研究[A];第一届全国口腔颌面部肿瘤学术会议论文汇编[C];2001年
4 陈紫千;汤耀卿;张圣道;韩天权;毛恩强;雷若庆;;白细胞介素10腺病毒基因治疗重症急性胰腺炎的实验研究[A];中华医学会第10届全国胰腺外科学术研讨会论文汇编[C];2004年
5 郑骏年;孙方浩;李望;毛立军;刘俊杰;温儒民;孙晓青;;荷载hTERT siRNA的条件增殖型腺病毒抑制肾癌生长的体内外实验研究[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
6 郑骏年;孙方浩;李望;毛立军;刘俊杰;温儒民;陈家存;;荷载Ki67 siRNA的条件增殖型腺病毒抑制肾癌生长的体内外实验研究[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
7 刘林;张曦;罗成基;粟永萍;陈幸华;;腺病毒载体介导的TPO基因治疗促放射伤鼠造血功能恢复作用的观察[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年
8 牛建强;夏咸柱;扈荣良;张守峰;黄耕;;应用细菌分子间同源重组机制快速克隆腺病毒基因组的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
9 田有勇;孙圣刚;王家宁;汤翠菊;冯媛;王岚;陈小武;乔娴;;腺病毒介导的血管内皮生长因子基因转移保护帕金森病大鼠多巴胺能神经元[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年
10 刘彦群;蒋冠;魏志平;郑骏年;毛立军;裴冬生;;携带IL-24基因的条件增殖型腺病毒联合达卡巴嗪诱导黑色素瘤细胞凋亡的研究[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 聂明明;hTERT启动子调控的增殖型腺病毒携带内皮抑素基因治疗胃癌的实验研究[D];第二军医大学;2002年
2 陈雄;携带内皮抑素基因增殖型腺病毒治疗卵巢癌的实验研究[D];第二军医大学;2006年
3 徐建国;携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒对结肠癌的治疗作用[D];第二军医大学;2003年
4 薛绪潮;携带白细胞介素-12基因的增殖型腺病毒治疗胃癌的实验研究[D];第二军医大学;2002年
5 陈县城;白介素(IL)-12基因修饰间充质干细胞(MSCs)的抗肿瘤形成与抗转移研究[D];四川大学;2005年
6 许刚;骨髓基质干细胞表达小鼠白介素-18治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究[D];南方医科大学;2008年
7 石琳;腺病毒介导的突变型人胰岛素原基因转染人脐带间充质干细胞[D];中国协和医科大学;2008年
8 徐中华;腺病毒介导的PTEN基因治疗肺癌的实验研究[D];苏州大学;2006年
9 郭明高;表面抗体基因在肝移植中抑制乙型肝炎病毒再感染的实验研究[D];第二军医大学;2005年
10 赵华;人可溶性TRAIL重组腺病毒治疗肝癌的实验研究[D];苏州大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吴清;内皮抑素基因联合持续低剂量顺铂治疗胰腺癌的实验研究[D];苏州大学;2005年
2 郭寿贵;人低氧诱导因子1α及其突变型重组腺病毒载体的构建[D];第一军医大学;2005年
3 李敏然;腺病毒介导HBV载体表达双靶位shRNA抑制HBV转基因小鼠体内HBV表达的研究[D];河北医科大学;2007年
4 王同建;血管生成素靶向RNA干扰抑制食管癌生长的实验研究[D];第二军医大学;2006年
5 孙树洋;Ad-hBMP-2基因转染骨骼肌卫星细胞体外成骨分化的实验研究[D];山东大学;2006年
6 孙洋;骨形态发生蛋白4非复制腺病毒基因治疗大鼠胫骨缺损的实验研究[D];安徽医科大学;2007年
7 柯小亮;涎腺腺样囊性癌转基因治疗研究[D];吉林大学;2009年
8 陈少杰;腺病毒介导的p21基因转染治疗大鼠左向右分流型肺动脉高压的研究[D];山东大学;2007年
9 陈渝;腺病毒介导NGF对大鼠周围神经损伤的疗效研究[D];重庆医科大学;2007年
10 郭曲;重组腺病毒介导P53基因治疗子宫内膜癌的体外研究[D];大连医科大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 谭勇 洪天语;速度与观念“双赢”[N];医药经济报;2004年
2 本报记者  赖强;病毒疗法掀抗癌药研发热浪[N];医药经济报;2006年
3 王新佳;“今又生”领军我国基因药物治疗[N];中国高新技术产业导报;2005年
4 中国医学科学院肿瘤医院原副院长 王建璋;癌症的基因治疗[N];保健时报;2004年
5 肖绍文 张珊文;肿瘤基因治疗聚焦p53基因[N];中国医药报;2005年
6 周雨;基因治疗 现代医疗技术的一次革命[N];科技日报;2001年
7 孙开来;基因治疗,“重组”治疗方式的“基因”[N];医药导报;2004年
8 通讯员 李运红 记者 刘道安;我国利用基因治疗恶性肿瘤受到关注[N];中国中医药报;2001年
9 深圳商报记者 王美华 张为真;抗癌新药“今又生”在深诞生[N];深圳商报;2003年
10 展萧;首家基因治疗肿瘤中心在京启用[N];科技日报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978