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血管生长素基因转染后的骨髓基质细胞移植于缺血心肌的实验研究

李志刚  
【摘要】: 全世界每年都有数以千万计的患者被诊断为充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF),其中大多数是由于心肌缺血和梗塞造成的,尤其是在发达国家,甚至在我国也是一样。 为了治疗缺血性心脏病和由之引起的心力衰竭,人们想了很多办法,这里面包括药物治疗、心脏移植、机械辅助甚至全人工心脏、心肌成形和CABG等手术疗法。但对于大面积、弥漫性的冠心病患者来说,以上方法都很难遏制和逆转病情的发展。虽然心脏移植是治疗终末期心衰的理想手段,但由于供体有限,北美地区也只有15%-20%的患者能够有幸接受此项手术。因此,作为一种很有希望心衰治疗手段,细胞移植在过去的10年中逐渐引起了人们的注意;几乎与此同时,治疗性血管新生在改善缺血性心脏病患者心功能方面也表现出了满意效果。虽然心力衰竭的确切机制还没有完全被揭示,但心室重塑(ventricular remodeling)和血供不足肯定是晚期缺血性心脏病的最主要病理基础。因此,通过细胞移植置换疤痕组织,和通过血管生长因子的持续有效表达促进血管新生肯定是很有希望的两种治疗手段。 已经有很多细胞被研究用来作为缺血心肌内细胞移植的供体。到目前为止,大部分学者都认为未成熟细胞或干细胞更适合于在缺血环境内移植,因为它们具有更强的耐缺血能力,而且干细胞在自体缺血心肌环境内还能够分化为心肌样细胞。另外,人们已经将多种血管生长因子用于临床Ⅰ期实验,初步结果表明促血管生长作用满意。ANG是一种性能非常优越的促血管生长因子,我们实验室已经报道了ANG蛋白在缺血心肌内的良好的促血管生长作用。 因此,我们认为如果将表达ANG基因的自体骨髓基质细胞移植于缺血心肌后能从下面两个方面改善心功能:①通过移植细胞置换疤痕坏死组织;②通过血管新生改善局部血运、挽救自体受损心肌,并为移植细胞提供一个更好的生长环境。 本课题主要研究方法: 1、BMSCs的体外分离培养和向心肌样细胞的诱导分化 霓二旱区大纱协士学t住不 申不灼县 用叱外朴寺丛 盼 分别利用贴壁法和Pi。。11梯度离心法体外分离培养BMSCs,培养于含20%胎牛 血清的IMDM培养基内,比较其在不同分离方法下的获取数量、增殖速度。通过CD71、 CD34、Vlll因子兔疫组化染色和流式细胞技术进行细胞成份鉴定。应用 卜氮胞昔 u-Azaghdine,5-aza)体外诱导 BMSCs中间质干细胞向心肌样细胞分化。 2、Ad.ANG体外转染BMSCS及其促血管内皮细胞增殖作用研究 利用贴壁法分离培养 BMSCs后,首先通过转染 p-半乳糖昔酶 (Lac)基因评价腺 病毒转染**So后的转染效率和细胞毒性作用:然后通过免疫组化、地幻***-81以 .____、、…_.。_.__.._…_。_,__…..、、..—_、—。-. 一 和ELISA方法分别检测ANG在细胞内表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞与含 有ANG的条件培养基共培养,研究ANG的体外促内皮细胞生长作用。 3、转染Ad.ANG后的BMSCS移植于缺血心肌的实验研究 选取同基因背景的ie。is大鼠为研究对象,共42只,体重2009-2509。通过左侧 开胸缝扎左冠状动脉前降支,建立心梗模型,4周后超声检测心功能。分组用药:组1 (BMSCs.AdjANG组人 注射体外转染 AdjANG的 BMSCs 3 X 106乃0ul,n=14;组* (BMSCs组):注射 BMSCs 3 X 106/50ul,n二8;组*(Ad/ANG组):注射 Ad.ANG 5 . X10Yhe50ul,n==8;对照组(IMDM组):注射无血清IMDM培养基50ul,n叫。细 胞移植前均经 5—aza诱导和涣氮胞苦(BrdU)标记。4周后超声评价心功能。每组 8 只动物进行组织病理学检查,另外组1和对照组各取6只和4只动物送检电镜,主要观 察细胞存活分化和血管新生情况。 本课题主要结果 l、经形态学观察和 CD71、CD34、Vlll因子免疫组化检测,显示 BMSCS是以间质 干细胞为主(>90%)的多种细胞的混合体,*D刀流式细胞仪检测显示间质干细胞含 量随培养时间延长而逐渐增加,比较贴壁法和Fi。。11梯度离心法,前者的细胞获得量更 . 多。通过形态学和组织学鉴定,证明BMSCs中的间质干细胞经5-aza诱导后分化为了 心肌样细胞。 2、腺病毒对于**既s具有很高的转染效率,*OI为so倍时,转染效率>95%, 而且对细胞生长没有明显影响。Ad.ANG转染BMSCS后,在细胞裂解物和培养上清中 都有ANG出现,4刁天时达到表达高峰*.808pg/mlX15天后仍可检测到蛋白表达。 含有ANG的条件培养上清具有明显的促血管内皮细胞生长作用。 3、细胞移植后4周,可以在缺血心肌内找到BrdU标记的BMS


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