糖皮质激素抑制人卵巢癌细胞系3AO、人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的分子机制

【摘要】： 乳腺癌、卵巢癌为激素相关性肿瘤，其中乳腺癌发病率占妇女肿瘤的31％，死亡率仅次于肺癌；卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，由于卵巢癌发病部位隐匿，不易早期发现，诊断较晚，且多种化疗药物易为患者所耐受，因此卵巢癌5年存活率一直维持在30％左右。已证实近90％的卵巢癌标本中含有糖皮质激素受体，50％含有雌激素受体和孕激素受体，95％含有雄激素受体。提示甾体激素在卵巢癌的发生发展过程中可能有重要作用。由于传统方法的非特异性，近年来人们对激素的治疗颇为关注。对甾体激素与卵巢癌细胞的增殖分化、转移等的研究表明，甾体激素可以通过内分泌、旁分泌以及自分泌途径影响卵巢癌细胞的增殖。乳腺癌的发生和发展受内分泌调控，其内分泌治疗已有百年历史，但卵巢癌的内分泌研究没有乳腺癌那么深入，迄今的结果也没有显示卵巢癌的发生和发展象乳腺癌与雌激素，前列腺癌与雄激素那样与甾体激素有明确的关系，表明卵巢癌的激素调控可能更为复杂。 糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)是调节生长、发育、分化以及内环稳境定的重要激素，几乎对所有细胞的生长及分化都有调节作用。糖皮质激素是治疗淋巴细胞白血病的主要药物之一，也是临床上应用最广泛的激素类药物。糖皮质激素对许多组织来源的肿瘤细胞均有增殖抑制作用和诱导分化作用，但就卵巢癌、乳腺癌细胞而言，有关报道尚不多见。本实验分四部分，第一部分研究糖皮质激素等甾体激素对人卵巢癌细胞系(3AO)、人乳腺癌细胞系(MCF-7)增殖分化过程的影响；第二部分研究3AO、MCF-7中有无糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)的表达，GCs抑制细胞增殖是否通过GR介导；第三部分研究GCs对3AO、MCF-7细胞周期及细胞周期蛋白抑制因子p21的影响；第四部分从信号转导途径的角度研究细胞外调节信号激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)通路激活状态对糖皮质激素抑制3AO、MCF-7细胞增殖状态的影响，以进一步阐明激素作用的分子机制。 我们首先观察不同浓度（10－‘’mol／L～10－’mol／L）的地塞米松 （dexamethasone，Dex，一种人工合成糖皮质激素）等笛体激素对人卵巢癌细 胞系（3A0）、人乳腺癌细胞系（MCF－7）生长分化过程的影响。结果发现Dex对 3A0细胞生长有明显的抑制作用，10’mol／L Dex作用 sd后细胞数为对照组的 50％，而雌激素、孕激素、雄激素对该细胞的增殖无明显影响。同时发现D6X对 3A0细胞分化有明显的诱导作用，表现在细胞分化标志抗原碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性增加及卵巢癌特异性相关抗原CA125表达降低。Dex对 MCF－7生长也有抑制作用，10’mol／L Dex作用 sd后细胞数为对照的 70％，AKP 活性增加为对照组的7倍。 糖皮质激素是一种脂溶性激素，可以自由通过胞膜进入细胞内，其作用主 要是通过特异的细胞内受体，即糖皮质激素受体格 receptor， GR）介导的。而GR是一种激素依赖性转录调节因子，其表达水平的高低决定了 靶细胞对激素的反应性。因此，为了阐明Dex调节细胞生长分化的分子机制， 在第H部分我们首先以AKP活性效应为指标，研究GR特异桔抗剂RU486对Dex 诱导AKP活性的影响。结果发现RU486本身虽然对AKP活性无影响，但可完全 阻断Dex对AKP活性的诱导作用，说明Dex对3A0、MCF－7细胞AKP活性的诱导 作用是由GR介导的。放射配体结合分析进一步证明3A0细胞中含有高亲和力、 1 容量、可饱和性 GR（Bmax＝92．26土23．30 fmol／10’cells，Kd二1．37士0．19 ＊m。1／U：肌卜7细胞中也有高亲和力、低容量、可饱和性肪（BXaX书2．18土13．64 fmol／10‘cells，Kd二1．77土0．12 nmol／L）；而且糖皮质激素作用后，两种细胞 系GR结合容量降低，具有时间、剂量依赖性，但受体亲和力无明显改变。因而 在受体蛋白水平上证实Dex对3A0细胞、MCF－7细胞GR有明显的向下调节作用。 第三部分通过流式细胞仪证实Dex作用3A0细胞后，使细胞停滞在G／G；期， S期细胞比率减少，同时Dex以时间和浓度依赖性的方式诱导p21／WAFI的表达， 该效应能被GR i抗剂RU486完全逆转，表明Dex与其受体结合后可通过诱导3A0 细胞PZI／IAFI的表达，介导了Dex诱发该细胞G。／G；期停滞过程。Dex作用MCF－7 细胞后，细胞周期也停滞在G／G；期，但P21州 的表达无明显变化。 由于有丝分裂激活蛋白激酶（mitogen－activated protein inase，MAPK）家族与 细胞增殖、分化过程密切相关，所以我们对3AO细胞、MCF－7细胞Eng活性 3 进行了研究，以确定它们是否与Dex引起的增殖抑制反应有关。我们采用针对 hr－X－TyT双重磷酸化的 ERK多克隆抗体，用 Western Blot方法研究 Dex对 3AO 细胞、MCF－7细胞ERK活性的影响。研究结果表明，Dex对3AO细胞、MCF－7 细胞EKK活性具有快速抑制作用，在5分钟即出现效应，并有浓度依赖性。该 作用不能被RU486所阻断，说明该效应是不依赖GR的。进一步的研