VEGF增加内皮细胞对脂蛋白通透性的机制研究

【摘要】： 血管内皮生长因子/血管通透因子（VEGF/VPF，以下简称VEGF）能增加血管内皮对多种生物大分子的通透性。在动脉粥样硬化（AS）斑块和泡沫细胞中检测到VEGF，提示VEGF可能与AS发生发展有关，但VEGF 在AS发生发展过程中的确切作用目前仍不清楚。本实验拟在体外培养的内皮细胞单层和与平滑肌细胞共培养的双层中研究VEGF对AS的危险因素――低密度脂蛋白（LDL）通透性的影响，以探讨VEGF在AS发生发展过程中的作用。 内皮细胞的细胞外基质（ECM）在通透性调节方面具有重要作用。IV型胶原是内皮细胞特异性ECM成分。基质金属蛋白酶-2/明胶酶A（MMP-2）是体内两种特异性IV型胶原分解酶之一，在通透性调控方面具有重要作用。本实验还将研究VEGF对MMP-2产生和活性的影响，以探讨VEGF促通透作用与MMP-2活性改变以及由此导致的基质分解的关系。 方 法： 用异硫氰酸荧光素（FITC）标记LDL，荧光分光光度法测定FITC-LDL的含量；在牛主动脉内皮细胞（BAEC）单层和与平滑肌细胞（BASMC）共培养双层上研究VEGF对LDL通透的影响和药物的拮抗作用；用免疫组织化学方法检测细胞内MMP-2的表达和水平；ELISA方法测定内皮细胞培养上清中MMP-2的含量；明胶酶谱法检测上清中明胶酶的活性；Northern blot方法定量内皮细胞内MMP-2 mRNA；RT-PCR和Northern blot方法检测内皮细胞内膜型基质金属蛋白酶（MT1-MMP）mRNA水平, ~3H-L-脯氨酸掺入法测定内皮细胞和平滑肌细胞胶原合成，3H-L-脯氨酸标记基底膜用于内皮细胞基底膜胶原的降解测定。 结 果： （1） FITC标记LDL和荧光分光光度法测定FITC-LDL含量方法的建立。结果显示此方法操作简单、可行，灵敏度高，标准曲线线性好，且培养液对测定结果无干扰； 基于PET膜的内皮细胞单层和与平滑肌细胞共培养双层的通透性实验方法。在PET膜上种植BAEC或在膜的两侧同时培养BAEC和BASMC，F-肌动蛋白染色和光镜观察鉴定单层形成，待单层形成后测定基础通透以剔除单层融合不全的孔。此外考察了FITC-LDL对内皮细胞单层生长状况的影响。结果显示，在实 WP=5 （2） 验中使用的最高剂量（125μg/ml）和最长作用时间（6小时）内，未见FITC-LDL对内皮细胞单层状态和细胞活力产生明显影响； （3） VEGF能显著增加内皮细胞对LDL的通透性，且作用随着剂量增加而增强，在50μg.L-1时即有显著作用，通透率从19.07±1.13%上升到22.46±1.59%（P0.05），在100μg.L-1时通透率进一步增加到27.13±2.27%，作用非常显著（P0.01），200μg.L-1时作用强度不再增加； （4） 欧芹素乙10μmol.L-1显著抑制VEGF增加LDL通透性的作用，通透率从27.04±2.20%降低到22.78±1.37%（P0.05），100μmol.L~{-1}欧芹素乙非常显著地抑制VEGF的作用，通透率从27.04±2.20%下降到20.83±1.31%（P0.01）。与阳性对照药丹酚酸B相比较，欧芹素乙作用弱于丹酚酸B； （5） 基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抗体显著抑制VEGF促进的BAEC单层对FITC-LDL的通透性，提示MMP-2介导的基质分解过程可能与VEGF的促通透作用有关； （6） VEGF能显著增加BAEC和BASMC共培养双层对LDL通透性，且作用随着时间增加而增强，与对照组相比，1、2h作用无显著差异，4h通透率从对照组的18.02±1.68%增加到25.11±1.73%（P0.01），6h作用进一步增强，从对照组的19.88±1.75%增加到28.10±1.59%（P0.01）。与单层培养相比较，作用具有延迟性，需要在较长时间（4小时）才能达到显著水平； （7） VEGF能剂量依赖性地增加BAEC和BASMC共培养双层对LDL通透性，在50μg.L-1作用即具有显著意义，通透率从18.40±1.45%增加到21.60±1.73%（P0.05）,100μg.L-1时通透率进一步增加到25.38±3.32%（P0.01）,200μg.L-1作用不再进一步增加。量效关系与单层情况相似； （8） 免疫组化方法检测VEGF对BAEC细胞产生和表达MMP-2的影响。BAEC在基础条件下也能表达一定水平的MMP-2，在VEGF刺激下表达增加。ACE异染的红色阳性颗粒主要位于细胞浆中，BAEC细胞核经苏木精复染成紫色。颗粒图像分析结果显示，VEGF刺激下的BAEC细胞阳性率为空白对照组的2.2倍，两者比较差异非常显著 (P〈0.01〉。 ELISA方法测定ECV304细胞上清中MMP-2蛋白含量。VEGF剂量依赖地促进ECV304细胞产生MMP-2，50μg.L-1VEGF显著促进MMP-2产生，与对照组相 WP=6 （9） 比增加22.56%（P0.05）， 100μg.L~{-1}VEGF刺激作用进一步增强，与对照组相比增加26.02%，（P0.01）。 （10） VEGF对ECV304细胞MMP-2活性的影响和药物的抑制作用。VEGF（10-100μg.L~{-1}）能促进72kD MMP-2分解明胶底物的活性。以空白组的积分灰度值为100， 50μg.L~{-1}和100μg.L~{-1}VEGF作用组的积分灰度值分别为167±17.35（P0.05）和259±20.95（P0.01）。1μmol.L-1丹酚酸B和100μmol.L~{-1}欧芹素乙对100μg.L~{-1}VEGF具有非常显著的抑制作用，分别抑制了69.8%（P0.01）和85.3%（P0.01）。 （11） VEGF对BAEC细胞MMP-2活性的影响和药物的抑制作用。VEGF（10-100μg.L~{-1}）能促进72kD MMP-2分解明胶底物的活性。以空白组的积分灰度值为100，10，50和100μg.L~{-1}VEGF组的灰度值分别