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重组胸腺素α1的表达和纯化研究

苗红  
【摘要】: 胸腺素α1(thymosin 1,Tα1)是由28个氨基酸组成的酸性多肽,等电点4.2,相对分子量3108,其氨基酸序列为:N-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C[1,2]。Tα1具有多种免疫活性,可以促进T淋巴细胞的成熟和分化,促进成熟的T细胞、自然杀伤细胞分泌各种细胞因子如IL-2、INF-α等,同时也促使高亲和力白介素-2受体的生成[3-10]。近年来的研究发现,Tα1还具有一些其他的生物学活性,如它能拮抗糖皮质激素、某些凋亡因子诱导的胸腺细胞的凋亡[11,12],刺激血管内皮细胞迁移,促进血管生成和伤口愈合[13],降低脂质水平[14,15]和提高精子活力[16,17]等。目前已用于乙型肝炎[19,22]、丙型肝炎[21,23,26]、恶性肿瘤[18,20,25]及免疫缺陷疾病等[24,27]的临床治疗和研究中。 Tα1最早是Goldstein等[1]从牛胸腺组织提取的胸腺五肽(TF5)中分离出来的,目前临床所用的Tα1制剂有两种来源,一是采用固相合成法全合成[28,29],二是从小牛胸腺中提取[1,30]。组织提取法受到材料来源的限制,产量低,通常都是胸腺素多肽混合液;目前Tα1单体均为通过化学合成方法获得,成本高,价格昂贵。 我们对基因工程方法生产Tα1进行了探索,首先将Tα1基因克隆于pGEX-4XT-1载体,构建了融合表达载体。重组质粒转化大肠杆菌DE3(Lys)后,获得了Tα1的高水平融合表达。为了获取大量的目的蛋白,我们在NBS-MICROS15L.T.D.R生物反应器中,对工程菌进行分批培养和补料分批培养。分批发酵的最终菌体密度OD(600)为5,GST-T1融合蛋白的含量约 56mg/L(发酵液);通过分批补加甘油,增大通气量和加快搅拌以促进溶氧,能大大提高菌体密度,在OD(600)达10左右加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3h,发酵最终菌体密度可达OD(600)22,每升发酵液中GST-T1融合蛋白的含量约0.26 WP=4 克。表达的融合蛋白主要以可溶形式存在于宿主细胞内,超声破菌后,融合蛋白的含量占上清蛋白总量的30%以上。融合蛋白的纯化采用亲和层析法,纯度大于95%。融合蛋白经凝血酶裂解后,释放出Tα1单体,先经亲和层析除去酶切后产生的谷胱甘肽-硫-转移酶(GST),然后通过离子交换纯化Tα1,纯度大于90%。 我们对纯化的Tα1进行了生物学活性检测,结果显示,与阴性对照相比,Tα1能显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率(P0.01),在10-7、10-8、10-9、10-10mol/L浓度对小鼠脾细胞增殖有明显促进作用(P0.01),其活性与进口合成Tα1相似。 我们所建立的方法可以克服小分子多肽在大肠杆菌中表达的困难,发酵稳定性好,提取纯化方法简便,易于放大和工业化生产,为今后基因工程大规模生产Tα1打下了基础


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