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急性缺氧对大鼠海马神经元NMDA诱发电流的影响及GDNF作用机制的研究

林毅勇  
【摘要】: 脑血管病是人类最常见死亡原因之一,同时也是神经系统最常见的致残性疾病,其发病率随年龄增长而升高。脑血管病通常由于动脉损伤而引起,包括出血和缺血,脑缺血约占脑卒中的三分之二。缺血性神经元损伤是一个复杂的病理生理过程。脑缺血后,糖和氧的供应随之减少,维持膜电位和跨膜离子梯度的细胞能量储备被耗竭,细胞膜去极化,导致钙离子通过电压门控式钙离子通道内流,触发神经递质如 。谷氨酸(glutamate,GLU)从突触前神经末稍释放。GLU与突触后神经元膜上的受体相结合,导致钠离子和钙离子内流,引起一系列的生物化学级联反应。由于兴奋性氨基酸(excitatory amino acids,EAAs)如GLU在这当中处于极其重要的位置,所以被称为兴奋毒性。EAA有多种受体,其中以NMDA受体最为重要。 脑缺血后,多种神经营养因子及其受体表达上调,并对缺血性损伤起保护作用。胶质细胞源性神经营养子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)即为其中之一种,它可能通过减轻NMDA的毒性反应而发挥作用。NMDA受体是中枢神经系统中最主要的兴奋性递质门控离子通道受体,在本研究中,我们应用常规全细胞膜片钳技术,在原代培养的大鼠海马神经元上记录NMDA诱发电流(I_(NMDA))在急性缺氧时的变化,以及GDNF对I_(NMDA)的影响,并进一步探讨其作用机制及其与细胞内信号转导的关系。主要研究结果为: 1.明确了原代培养新生SD大鼠海马神经元GLU和NMDA诱发电流的一般特征。在钳制电压(Vh)=-60mV,灌流液中不含Mg~(2+)时,100μM GLU和100μM NMDA均可在海马神经元上诱发出一大的内向电流,I_(GLU)和I_(NMDA)呈明显的内向整流性和失敏特性。 2.通过向细胞外液持续充以95%N_2+5%CO_2的混合气体建立神经细胞体外急性缺氧模型。在钳制电压为-60mV时,维持全细胞模式不变,原代培养海马神经元急性缺氧2min后,细胞外给予100μM NMDA可诱发一大而增强的I_(NMDA),其峰值显 第二军医大学博士论文中文摘要 著增大。 3.细胞外单独给予GDNF(0 .1,1,1 ong/ml)对膜电导及电压门控的离子通道 无明显影响:细胞外同时给予100林M NMDA和10ng/ml GDNF,GDNF对NMDA 诱发电流的峰值有抑制作用,峰值抑制率为21.502%。除去细胞外的GDNF,INMDA 峰值迅速恢复到正常,即GDNF对INMDA的作用呈可逆性。 4.通过电极向细胞内加入0.5林M staurosporine(pKA和PKC的广谱激酶抑制 剂),staurosporine本身对细胞外100林M NMDA诱发电流的峰值有强烈的抑制效应, 一些细胞fL乎看不到宏观的INM。A。细胞外同时应用1 ong/ml oDNF和1 00林M NMDA 时INMDA的峰值进一步减小,GDNF对INMDA的抑制率从正常电极内液时的21 .502% 变为24.351%,似乎有所增加,但无统计学意义。 5.当细胞内给予50林M KN一62(CaMKn抑制剂)时,对INMoA无明显的抑制 作用,但可阻断GDNF对INMDA的抑制作用。 以上结果提示,NMDA受体参与了急性缺氧后的兴奋毒性以及GDNF的神经保 护作用。急性缺氧可使海马神经元膜上NMDA受体活性增加而过度激活,或使 NMDA受体数量增加,从电生理学角度直接证实了NMDA受体参与了急性缺氧后 的兴奋毒性的产生。GDNF对原代培养海马神经元INM队有抑制作用,这可能是它 发挥神经保护作用的机制之一,说明在急性脑缺氧时,GDNF可通过抑制NMDA受 体激活的功能或减少受体数量而发挥神经保护作用,此作用可能与PKA/PKC有关, 也可能与CaMKH有某种非直接的关系,至于具体关系如何,有待于进一步研究。


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