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携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒对结肠癌的治疗作用

徐建国  
【摘要】: 研究背景及目的: 结直肠癌在我国的发病率有逐年上升趋势,目前已经是仅次于肺癌和胃癌的第三位常见恶性肿瘤。与胃癌、肺癌和肝癌等相比,结直肠癌的预后尚可。影响其疗效的最主要因素是病期的早晚,Dukes A期根治术后5年生存率超过90%,但DukesC期则仅有30%左右,其主要的死亡原因是区域淋巴结或远处转移,特别是肝脏转移。由于多数的结直肠肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗不敏感,因而对手术不能切除和发生区域淋巴结及远处转移的肿瘤目前尚无理想的治疗方法。 实体肿瘤的一个重要特征是通过新生血管的生成满足其不断生长所需的丰富血供,新生血管生成在肿瘤的生长和转移过程中起着决定性的作用。抑制肿瘤新生血管生成已成为肿瘤治疗的新方向。在已发现的几种新生血管抑制剂中,以内皮抑素(Endostatin)的作用最为明显,内皮抑素可显著抑制体外血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞增殖、迁移和血管生成以及实验动物实体肿瘤的生长和转移,长期用药无免疫原性和耐药性等问题发生,同时无论是在动物实验还是在已经结束的Ⅰ期临床实验中都没有明显的毒副作用。有资料表明结肠癌组织内的VEGF表达和微血管密度(MVD)与结肠癌的复发、转移等生物学行为密切相关,内皮抑素通过抑制新生血管的生成可显著抑制结肠癌肿瘤的生长和预防肿瘤的肝转移。 由于内皮抑素纯蛋白直接注射给药治疗肿瘤所需剂量大(20mg/kg/day),传统的生物工程方法表达生产量低,体外活性难于保持,妨碍了内皮抑素的直接临床应用,用基因治疗的方法有望解决这一问题。通过增殖缺陷型腺病毒载体介导的基因治疗的方法获得持续高浓度的内皮抑素基因表达在以往的研究中已取得了一定的治疗效果。但由于对早期增殖缺陷型腺病毒载体的改造出于安全原因的考虑缺失了腺病毒复制必需的大部E1区基因,同时也限制了其在肿瘤细胞内的复制和治疗基因的有效表达。由于内皮抑素在体外抑制内皮细胞的增殖和体内抑制肿瘤的生长及转移均为剂量依赖性的作用方式,因而一个高效的基因导入载体系统必将对内皮抑素充分发挥其抗肿瘤新生血管生成的治疗有着深远的意义。同时基因治疗的靶向性 【 第二军医大学 中文摘要 博士论文 和安全性问题,即如何将治疗基因特异性地传输到肿瘤细胞,从而在肿瘤细胞中得 到高效的表达,同时尽可能不侵害正常细胞也是基因治疗必需考虑的另一个关键问 题。 肿瘤特异性增殖型病毒的出现为肿瘤的基因治疗提供了一个新的思路。近年来 随着病毒学和肿瘤学的不断发展,对保留Ela基因的肿瘤选择性溶瘤增殖腺病毒的 研究工作取得了很大的进展,弥补了增殖缺陷型腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的某 些不足。溶瘤增殖型病毒可以特异性地在肿瘤细胞中复制、增殖并裂解肿瘤细胞。 病毒携带抗癌基因后,该基因可随着病毒在肿瘤细胞内的复制得到高效的表达,在 肿瘤原发灶及转移灶局部形成高浓度抗癌因子,两者协同作用将进一步提高肿瘤的 治疗效果。 美国ONYX药物公司研制的ONYX-0 15是Elb55Kda蛋白编码基因缺失的2型和 5型腺病毒嵌合体,可在P53基因突变的肿瘤细胞内特异性增殖而不影响正常细胞。 P53抑癌基因是人体恶性实体瘤最常见的一种可突变基因,有资料显示约70%的结、 直肠癌细胞为p53基因突变型。我们前期的实验工作成功地构建了一个Elb55Kda 基因缺失的增殖型腺病毒载体系统:CNHK200。此外利用RT-PCR的方法从人体正常 肝脏组织总RNA中获得了人内皮抑素的全长CDNA。为了比较增殖型和增殖缺陷型 腺病毒载体在抗肿瘤新生血管生成治疗方面的差异,本实验将人的全长内皮抑素基 因克分别克隆入增殖型和增殖缺陷型腺病毒载体,观察了二者对体外培养的结肠癌 细胞和荷人结肠癌裸鼠的治疗作用,对携带人内皮抑素基因的肿瘤特异性增殖型腺 病毒的抗肿瘤机制进行了初步探讨,为结肠癌的基因一病毒治疗、抗新生血管生成 的治疗提供了新的思路。 方法和结果: l、携带人内皮抑素基因的增殖型及增殖缺陷型腺病毒载体的构建和制备 本部分研究首先通过分子生物学技术,利用重叠PCR的方法在hEndo基因片段 的 5’端引人 M一成瘤蛋白信号肽序列,并在其两端分别生成 EcoRI和 Xbal酶切位点 后定向克隆入测序质粒载体 pBluescriptll SK中。测序鉴定正确的质粒 pBlue-hEndo 以EcoAI和 Xbal双酶切后将5’端包含M一成瘤蛋白信号肽序列的hEndo基因定向克 隆入增殖缺陷型腺病毒穿梭质粒载体pCA13中。该载体的两个Bglll位点之间为包 含了CMV启动子十人内皮抑素基因十SV40polyA力尾信号的外源基因表达盒。质粒 4 第二军医大学 中文摘要 博士论文 pCA13-hEndo以Bglll酶切后将包含了CMV启动于十人内皮抑素基因十SV40polyA 加尾信号的表达盒克隆入增殖型腺病毒穿梭质粒载体pXC7C中。 随后通过Lipofectamine2000的万法将质粒pCA1


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