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PC12细胞、稳定表达TrkA的Cos-7细胞在神经生长因子刺激下的蛋白质组学研究及褪黑素对多巴胺能神经元的保护作用

王国权  
【摘要】: 神经细胞的增殖、分化和存活是神经科学研究领域的重要内容。为进一步研究神经系统疾病的发病机制及神经细胞分化过程中的信号网络调控机制,有助于神经系统疾病的治疗研究,目前已建立起多种细胞模型以研究神经细胞的分化。 本研究首次应用稳定表达TrkA的Cos-7细胞株,成功建立了一种新型的人工神经细胞分化模型,并分别从形态学和蛋白质水平得到了证实。 本研究利用双向电泳技术,在神经生长因子刺激下,分别在人工的神经细胞分化模型稳定表达TrkA的Cos-7细胞株和公认的神经细胞分化模型PC12细胞株上,发现了可能与神经细胞分化相关的蛋白质群,为神经细胞分化研究开辟了新的视野。 本实验还研究了褪黑素在体外对多巴胺能神经元的保护作用。 第一部分 稳定表达TrkA的Cos-7细胞株在NGF刺激下的蛋白质组学 研究目的 中文摘要 通过NGF刺激稳定表达‘rrkA的Cos-7细胞株,建立一种人工神经细 胞分化的人工模型,寻找与神经细胞分化相关的蛋白质。方法用 50ng/ml的NGF刺激稳定表达’rrkA的Cos-7细胞株,观察0,1,3, 5天的形态学变化;免疫组织化学检测Cos-7细胞MAP一2蛋白质的 表达;经’Western blot方法用4G10抗体检测酪氨酸磷酸化蛋白;双 向电泳比较分化前后Cos.7细胞全裂解液的蛋白质变化。结果稳定 表达’IrkA的Cos一7细胞株在NGF刺激下分化为神经样细胞,细胞体 和突起MAP-2染色阳性,’Western blot方法检测出NGF-TrkA信号转 导通路上的酪氨酸磷酸化蛋白,双向电泳发现了可能与神经细胞分化 相关的蛋白质群。结论人工模型Cos.7细胞可用于研究神经细胞分 化的机制,有70个蛋白可能参与了Cos一7细胞的分化过程,32个蛋 白在NGF刺激后含量升高5倍以上,38个蛋白在NGF刺激后含量 降低5倍以上。 第二部分 PCI2细胞在NGF‘刺激下分化前后的蛋白质组学研究 目的寻找与PCI2细胞株神经细胞分化相关的蛋白质。方法利用 双向电泳技术,对比50ng/ml浓度下NGF刺激3天后分化良好的PCI2 细胞与未分化的PCI2细胞蛋白质表达的不同。结果发现了可能与 神经细胞分化相关的1 1 6个蛋白质,86个蛋白质含量升高超过5倍, 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 30个蛋白质含量下降超过 5倍。结论 116个蛋白质可能参与了 PC细胞株的神经分化过程。 第三部分 褪黑素对多巴胺能神经元的保护作用 目的观察褪黑素对体外培养的大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元存 活率的影响。方法取孕龄14大大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元细胞体 外培养,加入 10”‘一IO-’M的褪黑素,24小时后观察存活细胞数。结 果在褪黑素浓度为 10“’一 10-’M时,存活细胞数明显多于对照组,差 异具有显著性。结论褪黑素对多巴胺能神经元具有保护作用。


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