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反义抑制增生性瘢痕TGFβ_1和TIMP-1的实验研究

汪滋民  
【摘要】: 目的:探讨特异性抑制人TGFβ_1、TIMP-1基因表达的方法,以促进胶原降解,减少胶原沉积,从而达到治疗增生性瘢痕的目的。 方法:1)设计合成特异切割人瘢痕组织中TIMP-1的锤头状核酶基因,克隆至U6载体,TIMP-1mRNA基因片段克隆至T载体。用体外转录法大量制备以[α-~(32)P]UTP标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验。2)应用特异切割TIMP-1和TGFβ_1 mRNA的嵌合型核酶基因克隆pU6-Rz182、pU6-Rz358、pU1Rz803,稳定转染增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar derived fibroblasts,HF),并结合γ射线照射提高转染率和外来基因整合。MTT、细胞周期检测核酶对细胞生长的影响,RT-PCR,western blot检测核酶对靶基因TIMP-1和TGFβ_1表达的抑制,细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白含量的改变。3)设计合成TIMP-1和TGFβ_1反义寡核苷酸,瞬时转染HF,检测其对靶基因的抑制作用和对胶原代谢的影响。 结果:1)体外实验表明:活性的U6 snRNA嵌合型核酶U6Rz182、U6Rz358有良好的特异切割TIMP-1的活性,而点突变型核酶U6Rz182m、U6Rz358m没有切割活性。2)γ射线可以促进质粒的转染和整合,核酶特异性抑制HF中TIMP-1和TGFβ_1的表达,使细胞生长被抑制,促进胶原降解,胶原蛋白的细胞内含量降低。3)反义核酸特异性抑制HF中TIMP-1和TGFβ_1的表达,促进了胶原的降解。 结论:1)体外制备的核酶具有良好的特异切割TIMP-1的活性。2)核酶和反义核酸能有效特异的抑制HF中TIMP-1和TGFβ_1的表达。3)TIMP-1和TGFβ_1都有促进HF增殖的作用,而其中的任何一个基因的表达被抑制后,HF的增殖都受到抑制。4)抑制TIMP-1的表达没有抑制胶原蛋白的合成,但大大促进了胶原降解,使HF胶原含量降低。5)抑制TGFβ_1既可促进胶原降解,又可抑制胶原合成。6)核酶和反义核酸有望发展成为针对增生性瘢痕的基因治疗药物。


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