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前列腺癌中自然突变的雄激素受体的功能研究

卢莹  
【摘要】: 前列腺癌(prostate cancer,PC)是雄激素依赖性的肿瘤。临床实践及体外细胞培养实验都证实,雄激素可以促进PC细胞的增殖,而通过内分泌疗法降低体内的雄激素水平或拮抗其作用可抑制肿瘤生长并可诱导肿瘤细胞调亡,因此内分泌治疗是临床中晚期PC的首选疗法;其方法包括手术去势(切除睾丸)、化学去势(使用雌激素、孕激素等抑制垂体分泌促性腺激素,从而减少雄激素的产生),以及使用雄激素拮抗剂(如CPA、Flutamide等)来对抗体内残留的肾上腺来源的雄激素等。但是临床工作也发现,部分患者在内分泌治疗一段时间后,会出现对内分泌治疗的不敏感或抵抗,原来对雄激素依赖的PC,转变为雄激素非依赖型的PC。这是患者肿瘤复发及死亡的重要原因,其机制迄今尚未完全阐明。 由于雄激素与PC的发生、发展和临床治疗关系密切,而雄激素的生物学效应是由其特异的雄激素受体(androgen receptor,AR)介导的,因此PC与AR的关系一直是PC研究中的热点之一。大量研究发现,AR基因突变所导致的AR功能改变,如转录激活功能增强或配体结合特异性的变化,在非雄激素依赖型PC的发生中具有重要作用。 本实验室曾应用PCR-SSCP及双链DNA循环测序法,对50余例PC患者肿瘤组织的AR基因进行了突变筛选,并检测出5种AR基因点突变(G142V、D221H、S296R、E872Q、M886I),其中G142V、D221H、S296R位于ARN端的转录激活区(TAD),E872Q、M886I位于ARC端的配体结合区(LBD)。由于此5种点突变均位于AR的功能区,并且其所属的5例病人都是恶性程度较高的雄激素非依赖型PC患者,因此对这5种AR点突变进行功能分析,将为阐明AR基因突变对AR功能的影响及在PC发生、发展和治疗中的作用提供重要依据。 前期工作已证明,G142V、D221H、ES72Q、M886I四个突变体在CV-1细胞中确实存在功能改变,其中G142V、D221H转录激活功能比野生型AR(wild type androgen receptor,wtAR)有所增强,而E872Q则出现配体结合特异性的改变。本课题是对上述AR突变体功能分析的继续,主要内容包括:①构建了我们尚未研究过的AR突变体S296R的表达载体并对其进行雄激素结合特性的研究;②研究了突变体S296R在CV-1细胞中的转录激活功能;③对我室证实的五种AR突变体在前列腺癌细胞系PC3中的功能状况进行了研究。 男二幸遥认闷学硕士老戈 中文摘要 首先,我们采用重叠延伸的方法构建了AR突变体S2%R的表达载体,利用磷酸钙 介导的瞬时转染方法将其转染入无内源性AR表达的COS一7细胞中,用Westem blot方法 证实5296R表达载体能有效表达AR,其表达量、大小与州叭R一致。在此基础上,采用 完整细胞的放射配体结合测定法,研究了转染入COS一7细胞中的5296R的配体结合能力. 结果显示,s2%R与人工合成雄激素R1881的亲和力及最大结合容量与协八 AR相比无明 显差异,表明AR第296位的点突变并未影响其与雄激素结合的能力。 作为激素依赖性的转录调节因子,AR与雄激素结合后,在核内以同源二聚体的形式 与靶基因启动子中的雄激素反应元件(ARE)相结合,在共调节因子(coregulator)的参 与下,调节靶基因的表达,产生生物学效应。我们以连接小鼠乳腺肿瘤病毒MMTv启动 子的荧光素酶Luc作为报告基因(P MMTV-Luc,MMTv启动子中含有AR丑,因此Luc 的表达受AR调控)研究了AR突变体s2%R的转录激活功能。采用脂质体介导的瞬时转 染方法,将AR特异的报告基因pMMTV~Luc、wtAR或突变体AR(s296R)表达载体及 内参照基因pRLsV40一Luc共转染无内源性AR表达的cv-1细胞,然后分别用不同的配 体处理细胞,24h后检测Luc的活性。结果显示,在2/10一gmof几的二氢肇酮(DHT) 的作用下,突变体AR.(S2%R)诱导LUC的能力与,沈AR相似,二者均可将LUC的活 性提高约40倍,而且二者的诱导作用均能被雄激素拮抗剂cPA(2 X10一“mo比)所抑制, 表明52%R点突变并未影响AR对DHT的反应性。而在2、10一“mo比的雌二醇(E:)或 孕激素作用下,5296R对LUC的诱导水平明显高于v八AR,分别是认飞AR的1 .36倍和1 .30 倍(P0.05),提示突变使AR对EZ及孕激素的反应性发生了改变。 AR转录调节功能的发挥有赖于共调节因子的参与,为探讨5296R突变是否对AR与 共调节因子的相互作用产生影响,我们分别将共激活因子TIF一2、SRC一1、CBP、P300和 共抑制因子NcoR的表达载体与AR表达载体、报告基因pMMTV-Luc和内参照基因共 转染入cv-1细胞中,观察其转录激活功能的变化。结果显示,共转染TIF一2、SRC一1、 CBP及P300后,训叭R与5296R转录激活功能均明显增强,但二者相比,没有显著性差 异;而共转染NCOR后,二者的转录激活作用都受到显著抑制,其中对5296R的抑制更 明显(P0.05)。表明AR第296位的点突变影响了它与NCOR间的相互作用。 为了明确AR突变体的功能改变是否在前列腺癌细胞中同样存在,我们进一步在前 列腺癌细胞系PC3细胞中观察了其转录激活功能的变化。结果显示,转染林沈AR后,DHT 对LUC的诱导在PC3细胞中只有8倍左右,而Cv-1细胞中可以达到40倍。AR突变体 5296R在Cv-1细胞中的转录激活功能(EZ和孕激素作用下)有明显增强,而在PC3细


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