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原代培养海马神经元锌内稳态研究

秦海宏  
【摘要】:金属元素如锌、铁和铜等是所有生物体的必需营养素,在体内许多生物化学过程中发挥着重要作用,例如,构成酶的活性部位,参与体内电子传递,调控基因的表达等。然而,同样这些金属离子如果在体内蓄积过多,就会象镉、汞这些有毒金属离子一样产生细胞毒作用。因此,金属元素尤其是必需微量元素内稳态机制的研究日益引起人们关注。就锌的内稳态研究而言,国际上许多学者对锌转运过程进行了大量研究,从酵母、灌注小肠片段、内皮细胞、肠细胞株等模型的研究已经证明,ZIP(Zrt,Irt-like Protein)基因产物为锌铁转运体样蛋白,可介导锌的细胞内流及胞内再分布:ZnT(Zinc transporter)基因的表达产物为锌转运体蛋白,可促进锌的外排及细胞内转运至其他细胞器,DMT1(Divalent Metal Transporterl)可介导铁、锌等金属离子的细胞内流。然而,有关这些基因在中枢神经系统作用只有少量报道,主要只涉及ZnT1、ZnT3、DMT1等少数家族成员。 研究表明,突触间隙锌的过渡堆积与癫痫发作、精神分裂症、阿尔茨海默病患者淀粉样蛋白的形成等许多疾病密切相关;另外,由血栓阻断脑血流引起的缺血性脑中风已成为当今第三大致死原因及首位致残原因,而中风后神经元选择性、迟发性死亡与脑内可螯合锌水平密切相关。然而,神经系统锌内稳态机制至今还不清楚。以往认为,中枢神经系统Zn~(2+)的主要转运途径涉及电压门控Ca~(2+)通道、NMDA受体通道、金属硫蛋白(MTs)等,且离体研究多采用胶质细胞(或细胞株)。近年来,锌转运体ZnT、二价金属离子转运体DMT等家族成员在神经元发现提示,神经元也可通过锌转运相关基因的表达来调控自身的锌内稳态,然而,哪些基因参与调控、如何调控、调控能力的大小等等还缺乏系统研究。 目的 以原代培养海马神经元为模型,同时检测已确定的锌转运相关基因(rZIP、ZnT1、ZnT3、MT1、MT3、MT3、DMT1等)在原代培养海马神经元中是否表达,其表达是否受锌水平的调控,受调控的基因表达时相,并分析各基因表达的特点及内在联系,以及各锌转运相关基因mRNA表达时相与细胞内外锌浓度、细胞存活 第二军医大学博士学位论文 率之间的关系,以期发现维持海马神经元锌内稳态的主要相关基因,为阐明中枢 神经系统锌内稳态机制提供实验依据,为预防和治疗由于神经系统锌代谢紊乱而 引起的神经损伤及老年退行性神经疾病提供理论参考。 方法 1、原代培养海马神经元细胞模型的建立: 首先无菌分离新生大鼠海马,然后在显微镜下仔细剔除脑膜和全部毛细血 管,常规方法消化、收集海马神经元,以B一27神经元培养基培养6天后得到基 本纯化的海马神经元,最后通过在培养基中添加硫酸锌或锌离子络合剂TPEN,调 节培养基锌浓度,建立起不同锌水平培养的原代培养海马神经元细胞模型。 2、锌对海马神经元存活率的影响: 将细胞培养基更换成分别含(20 p mol/L TpEN,及。,50,100,125,250,175 200 p mol/L硫酸锌)的B一27培养基,每浓度组3孔,采用台盼蓝染色法并结合 神经元形态检测各浓度锌对原代培养海马神经元48h后存活率。 3、不同锌浓度培养对海马神经元含锌量的影响: 3.1不同锌浓度培养对神经元总含锌量的影响:10 p M TPEN及0,50,100,125, 150 p mol/L锌诱导30,180和360分钟后,分别用PBS、EDTA冲洗培养神经元, 用细胞刮刀碾碎并刮下神经元,以PBS收集各组神经元,用紫外吸收法测定蛋白 含量,用原子吸收分光光度法检测锌含量,计算相对蛋白含锌量,以ng(Zn) /mg(Protein)表示。 3,2不同锌浓度培养对神经元细胞质和细胞核含锌量的影响:分别检测10 pM TPEN及O,125,1 50 p mol/L锌诱导180分钟后海马神经元细胞质和细胞核含锌 量,步骤同上。 4、锌对神经元ZnTI、ZnT3、MTs、rZIP和DMTI等锌转运相关基因表达的影响: 采用实时荧光定量RT一PCR方法检测: 4.1锌对原代培养海马神经元ZnT一1、ZnT一3、MTI、MTZ和MT3 mRNA表达的剂量 效应:分别检测在O,50,75,100,125,150抖mol/L锌诱导4h后,各浓度组 海马神经元ZnT一1、ZnT一3、MTI、MTZ和MT3 mRNA的相对表达量(相对于p一aetin 5 第二军医大学博士学位论文 mRNA)。 4.2锌对原代培养海马神经元ZnT一、 效应:分别检测100 p mol/L锌诱导后, ZnT一3、MTI、MTZ和MT3 mRNA表达的时间 不同时间点(0,2,4,6,sh)ZnT一1、 ZnT一3、MTI、MTZ和MT3 mRNA表达; 4,3锌对原代培养海马神经元rZIP和DMTI mRNA表达的影响:分别检测对照组 (含1.2 p mol/L锌的B一27培养基)、低锌组(含10 p mol/L TPEN的B一27培 养基)和高锌组(含100 p mol/L硫酸锌的B一27培养基)诱导培养4h后,海 马神经元rZ工P和DMTI mRNA的表达。 5、统计方法: 数据以x士S表示,采用SPSS 1 1 .0软件包进行样本均数的方差分析。 结果 l锌对海马神经元存活率的影响: 1.1低锌培养〔10扒mol/L TPEN)条件下,海马神经元存活率为(32.5士4.95) %;培养基锌浓度大于125 p mol/L后,海马神经元存活率为(62.7土3,84)%~ (5.60士3.80)%,与对照组(95.47士1.68)%比较均显著下降(P(0.01


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