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环境内分泌干扰物重组酵母检测系统的建立

郑怡文  
【摘要】:近十多年来,大量的调查研究表明:环境中存在的多种化学物包括农药、工业化学物、环境污染物以及植物、真菌激素等,在进入人类和野生动物机体后,能干扰体内正常激素的合成、分泌、转运、结合及代谢等过程,从而激活或抑制内分泌系统的功能,并对个体或子代的健康造成危害,这类化学物质统称为内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals/endocrine disruptors,EDCs/EDs)。 环境中大量存在的内分泌干扰物可能危害人类和野生动物的内分泌、神经、免疫等系统的正常功能,从而导致内分泌紊乱、生长发育异常、出生缺陷和肿瘤的发生率增加、生殖能力下降等,严重影响人类的生存与发展。因此,环境内分泌干扰物的健康危害已引起生态学、内分泌学、毒理学等多个研究领域、诸多有关国际组织甚至政府部门的极大关注,成为目前国际上的研究热点之一。迄今为止在美国化学文摘中登记的化学物质已超过2316万种,进入人类生产、生活环境的就有数万种,这个数字每年还在快速的递增。我国作为一个发展中国家,伴随着工农业生产的高速发展,环境污染状况也日趋严重,已成为影响经济发展和人民健康的重大问题。因此,在建立快速、灵敏、简便的环境化学物质内分泌干扰活性的筛选、甄别系统的基础上,严格控制和治理环境污染物,对保护我国乃至全球的生态与环境、保障人类的健康以及提高生命质量都具有十分重要的意义。 环境内分泌干扰物中以雌激素和雄激素的干扰物为主,对人类健康影响最大,但目前针对环境雄激素干扰物开展的研究相对较少;而国内对这方面的研究尚处于起步阶段。目前已知大多数内分泌干扰物通过与激素受体的直接作用产生干扰效应,这类干扰物可以作为配体与激素受体结合,从而导致受体蛋白构型的改变、二聚化、与热休克蛋白等分子伴侣解离以及进一步的磷酸化等一系列变化,这种“活化”后的受体暴露其结构中的DNA结合区,并进而与靶基因启动子区域中作为顺式调控元件的激素反应元件(hormone response element, 第二军医大学博士学位论文 HR卫)发生特异性相互作用,对靶基因的转录表达发挥调节作用,并产生相应 的生物学效应。基于激素受体介导的报告基因转录激活效应的体外测评系统是 近年来发展起来的一种内分泌干扰物的检测方法,迄今为止在国内对自行构建 的环境雌激素报告基因转录激活检测方法的报道只有一例,而关于环境雄激素 干扰物报告基因转录激活检测方法的工作国内目前尚未见报道。 本研究根据内分泌干扰物通过激素受体介导调控靶基因转录表达的作用机 制和原理,在国内率先建立了环境雄激素干扰物重组酵母检测系统,同时又构 建了一个用于检测环境雌激素干扰物的重组酵母系统,作为快速、大量筛检环 境雌激素和雄激素干扰物的初筛方法,通过这两个系统的联合使用,其检测范 围基本可以涵盖环境中大多数的内分泌干扰物。本研究主要包括以下三部分内 容: 一、将人雌激素受体基因全长cDNA克隆到酵母表达载体pGBKT7中,构建 了能在酵母细胞中表达有活性的人雌激素受体蛋白的表达质粒pGBKT7/h ER; 同时人工合成一段雌激素反应元件(estrogen response element,E既),将两个串连 的ERE插入酵母报告载体pLacZi中报告基因p一半乳糖昔酶基因(lacZ)上游的 启动子区域内,从而构建了另一个携带有雌激素依赖性顺式调控元件ERE及由 E贬所调控的报告基因的激素作用报告质粒pLacZi尼RE。用以上两个质粒转化 带有互补的营养缺陷筛选标一记的酵母细胞,筛选重组酵母细胞株并建立了环境 雌激素干扰物重组酵母检测系统灯YpE侧ERE,通过检测外源性化学物质所诱 导的报告基因表达产物p一半乳糖普酶的活性,评价外源性化学物雌激素干扰作 用的活性强弱。 二、利用类似的技术和方法,将人的雄激素受体全长cDNA通过PCR扩增 后克隆到酵母表达载体pGI中,首先构建了能在酵母细胞中表达有活性的人雄 激素受体的激素受体表达质粒pG/叭R;同时采用寡核昔酸链定点突变法,将人 工合成的2个串联的雄激素反应元件(androgen response element,ARE)插入载体 YlpEREluc中报告基因萤火虫荧光素酶基因(luc)上游的启动子区域内,与此 同时将YIPEREluc载体上原有的ERE片段置换下来,从而构建了带有雄激素依 赖性顺式调控元件ARE及由ARE所调控的报告基因的激素作用报告质粒 第二军医大学博士学位论文 YIPAREluc。将以上两个质粒转入酵母细胞中,从而构建重组酵母细胞株,并在 此基础上建立了环境雄激素干扰物重组酵母检测系统BMApA卿AREluc,通过检 测外源性化学物所诱导的报告基因表达产物萤火虫荧光素酶的活性,评价外源 性化学物干扰雄激素作用的活性。 三、利用以上构建的两个环境内分泌干扰物重组酵母检测系统对17p一雌二 醇、己烯雌酚、双氢翠酮、双酚A、他莫西芬、氟他胺、o,P’一DDT、烷基酚、多 环芳烃、邻苯二甲酸酷类等18种化学物质进行了内分泌干扰物活性的检测,从 而对系统进行初步的评估和验证。结果显示:在构建的雌激素和雄激素两个检 测系统中,酵母所表达的雌激素和雄激素受体都具有生物活性,可以介导天然 激素和环境内分泌干扰物的作用,并在酵母


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