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人TH2细胞因子对异种血管内皮细胞保护作用及其机制的实验研究

陈刚  
【摘要】:目的: 器官移植中移植物血管内皮细胞(vascular endothelial cell VEC)是供、受者细胞间最早接触的部分,也是最早被受者免疫系统所识别的供体细胞。衬贴于器官移植物内的VEC与淋巴细胞之间的相互作用是启动和维持移植排斥反应的关键。VEC参与移植排斥反应是通过表达多种细胞表面分子而实现的,这些表面分子与淋巴细胞的募集和活化有关。粘附分子的表达如细胞间粘附分子—1(ICAM-1)与选择素—E(E-selectin)等在其中发挥着重要作用。淋巴细胞通过粘附分子而与VEC相互作用,进而向移植器官内募集。VEC与淋巴细胞的相互作用是双向性的,彼此之间形成了一个正反馈机制。VEC在移植排斥反应中既可以作为细胞因子和炎症因子作用的靶细胞,可以表达表面分子,产生多种活化分子和细胞因子,参与免疫反应的调节。粘附分子在移植免疫中的重要作用及其调控已成为目前研究的重要方向。本实验通过建立牛主动脉内皮细胞(BAECs)的体外培养,观察人Th2细胞因子(hIL-4、hIL-10、hIL-13)对异种EC表达细胞间粘附分子—1(ICAM-1)与E—选择素(E-selectin)的影响;观察人Th2细胞因子(hIL-4、hIL-10、hIL-13)对异种EC调亡的影响;揭示人Th2细胞因子(hIL-4、hIL-10、hIL-13)对异种EC保护性基因诱导作用;探讨Th2细胞因子对异种VEC的保护效应及其机制。 方法: 1.新生牛主动脉内皮细胞(BAECs)的培养、鉴定及形态观察 按Macarak的方法,加以改良。进行新生牛主动脉内皮细胞的原代培养,为进一步研究血管内皮细胞与排斥反应及移植物失活的关系、机理提供重要的实验手段;相差显微镜下观察细胞的形态学特点;透射电镜观察:凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色;放射免疫方法测定6-keto-PGF_(1α)和ET;以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制细胞生长曲线。 2.Th2细胞因子对内皮细胞表达ICAM-1与E-Selectin的影响作用研究 用Th2细胞因子(hIL-4、hIL-10、hIL-13)孵育BAECs 2h后,再与肿瘤坏死 布二乙军暇大举协士攀位愉大 中文摘鉴 舒胆外料令出 因子a(俐F一a、4ng/ml)共孵育6h或1 sh;Westem blot法检测E一selectin与ICAM一l 在BAECs细胞中的表达;免疫细胞化学染色法(ABc法)定性测定BAECs表面粘附 分子的表达。应用细胞一酶联免疫吸附分析方法(C ell.ELIsA)定量检测细胞表面的 E-selectin和IcAM一1的表达。用MTT方法测定ThZ细胞因子对细胞活性的影响。 3.ThZ细胞因子对内皮细胞调亡的影响作用研究 用浓度为Zong/ml的ThZ细胞因子(hIL一4、hiL一10、hIL一13)分别孵育BAEes Zh后,再与肿瘤坏死因子a(TNF一a、10ng/ml)共孵育12h、24h、48h、72h,应用流 式细胞分析方法检测BAECs的细胞调亡率;用浓度为20nglml的ThZ细胞因子(hIL一4、 hIL一10、hIL一x3)分别孵育BAECs Zh后,再与肿瘤坏死因子a(翎F一a、long/ml) 共孵育6h、18h,应用流式细胞分析方法检测表面的E-selectin和ICAM一1表达的百分. 率。 4.ThZ细胞因子诱导保护性基因在内皮细胞中表达的研究 用浓度为20ng八111的ThZ细胞因子(hIL一4、hIL一10、hIL一13)分别孵育BAECs 2h后,再与肿瘤坏死因子a(翎F一a、10呵mD共孵育48h,收获细胞;抽提其RNA, 行Rf-PCR,以扩增AZo mRNA、HO一1 mRNA。 里里: 1.BAECs细胞呈短梭形,多角形,胞浆丰满,核卵圆形居中,偶见双核。细胞之 间紧密连接,融合成片,互不重叠,呈典型的“铺路石”样;透射电镜观察,部分细 胞内可见内皮细胞特有的杆状WP小体:凝血姗因子相关抗原抗体免疫组化显示体外 培养的BAECs胞浆内及胞膜上富含棕褐色颗粒,细胞核呈蓝色,细胞轮廓清楚,呈 阳性反应。表明第姐因子相关抗原存在;内皮细胞分泌PG12和ET:内皮细胞第1、 4、7天分泌6一keto一PGF,。和ET的量在各时间点有明显统计学差异;细胞生长曲线近 似“S”形,传代后第2一5天细胞生长旺盛,第6天后进入平台期。 2.Westem blot法检测显示ThZ细胞因子能明显抑制ICAM一1与E一selectin在 BAEcs细胞中的表达;免疫细胞化学染色法(ABc法)测定显示ThZ细胞因子能明显 抑制BAECs表面粘附分子的表达。用ThZ细胞因子在一定浓度内预处理BAECs后, 各组ThZ细胞因子( hIL一4、hlL一10、hlL一13)能明显抑制TNF一a诱导的E一selectin与 IcAM一1的表达,并呈现一定的剂量依赖性。用M竹方法测定细胞活性的实验表明, 策二早皿大学俘士拳位论文中文摘蚕肝胆外科专也 各实验组细胞活性与对照组无明显差异性。 3.各组ThZ细胞因子(hIL一4、hIL一10、hIL一13)能明显抑制TNF一诱导的BAECs 细胞调亡,并与作用时间呈现一定的相关性;各组ThZ细胞因子(hiL一4、hIL一10、 hiL一13)能明显抑制TNF一a诱导的BAECs细胞表面E-seleetin与ICAM·1表达百分率, 并与作用时间呈现一定的相关性。 4.各组ThZ细胞因子(h IL一4、hIL一10、hIL一13)能明显诱导受TNF一a作用的 BAECs表达AZo mRNA、HO一l(hemoxgenase一1)mRNA,与对照组、TNF一a组呈明 显差异性。 全查: 1.证实培养细胞为BAECs,其形态与功能正常,具有血管内皮细胞的特性,符 合实验要求。为下丫步班窦塑墅退测些塑琏些塑迪蟹逛塑呸、机


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