GLYPICAN-3基因在非小细胞肺癌中的表达与意义

【摘要】：肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，也是全世界目前发病率和死亡率最高的癌症。然而由于肺癌的发病隐匿、恶性程度高、发展迅速、治疗困难，80％肺癌患者就诊时已处于进展期，传统的放疗、化疗及手术治疗并不能降低病死率，即使获得手术的病人的复发率也很高，因此一直是我国医学界面临的重大课题。大量研究表明肺癌的发生发展是一个多基因参与、多阶段发生、长时间形成而复杂的病变过程，这期间基因突变、原癌基因激活、抑癌基因失活及其导致一系列信号转导的异常等分子病理学改变贯穿了肺癌病变的全过程。因此，寻找筛选出方法简便、灵敏性和特异性可靠的肿瘤标记物，确定新的肺癌的干预靶点，从分子水平辅助肺癌的早期诊断，监测肺癌的发生发展及预后，及时进行基因生物治疗，促进肺癌的早期确诊率、治愈率有重大的临床应用价值。本文就这一目的以非小细胞肺癌(NSCLC)为研究对象，主要是寻找与NSCLC相关的基因，检测其在NSCLC中的表达情况，为该基因对NSCLC作用的基础研究和临床应用提供依据。 第一部分 阵列文库和基因芯片筛选肺癌相关基因 目的 寻找与NSCLC相关的基因。方法 利用平均插入子大小1.60kb的真核表达载体pcDNA3.1正常人胎盘cDNA质粒文库制备阵列文库，以此阵列文库进行PCR扩增，将PCR产物利用BioRobotics TAS多功能基因芯片点样仪点至尼龙膜上制备成阵列文库基因芯片。取2对NSCLC癌组织及其相对应的癌旁正常肺组织抽提其总RNA，反转录制成cDNA并行生物素探针标记，与阵列文库芯片杂交显影，观察尼龙膜基因芯片上分别与肺癌组织和正常肺组织杂交后差异显影的克隆点。结果 发现一个克隆位点在癌组织杂交芯片膜上特异性表达下降，癌旁正常肺组织杂交芯片膜上比癌组织杂交芯片膜上相对应的克隆点表达增强数倍。挑出该克隆，经基因测序后与Gene Bank比对，发现是Glypican家族中的Gtypican-3(gpc3)基因。结论 采用阵列文库中菌液直接点样制备基因芯片，与NSCLC癌组织和癌旁正常肺组织杂交，根据杂交结果中显色克隆点测序可以高效而节省地筛选到NSCLC相关的差异表达基因。首次发现了gpc3基因 第二.军医大学博侧卜学位论文中文摘要脚比，卜牛斗学专业 在正常肺组织和肺癌中明显表达差异。 第二部分命‘3帜NA在NSC比中的表达 目的研究即c3基因在NSCLC中的表达情况及其临床相关性意义。方法分别用 Northern Blot和Rl斗pCR半定量方法及实时荧光Rr-PcR检测gPc3基因在38例NSCLC 情况。结果Northem Blot和RT-PCR法在所有癌旁正常肺组织中均能检测到即c3 mRNA的转录，而在所有肺癌组织中均检测不到即c31llRNA。应用实时荧光RT-PCR 法定量检测gP时mRNA的转录水平，在肺癌组织中为0.0026士0.0024，在癌旁正常肺 组织中为0.0265士0.0119，二者相比相差显着(P0.0001)。癌旁组织与癌组织中g夕‘ 表达水平的比值在5倍以上的占84.2%，在2倍以上的占100%。结合病史病理指标分 析发现:即口在癌组织和癌旁肺组织中的表达差异与吸烟有关，在吸烟者癌与癌旁组 织中gPc3转录水平比值为0.054士0.0098，不吸烟者癌与癌旁组织中即c3转录水平比 值为。，1727士。，0143，两者相比差异显着(P0.01);即c3在癌组织和癌旁肺组织中 的表达差异同肿瘤大小有关，在直径蜀cm肿瘤中癌与癌旁组织gPc3转录表达水平比值 为0.1485士0.0215，在直径3cm肿瘤中癌与癌旁组织的表达水平比值为0.0528士0.01， 二者相差显着(PO.01);gPc3在癌组织和癌旁肺组织中的表达差异与患者的年龄、性 别、肺癌的病理分型(鳞癌、腺癌)、肿瘤病理分级、大体类型(周围型、中央型)、 有无胸膜侵犯、有无淋巴结转移等情况均不相关。结论印c3在NsCLC癌组织中普遍 特异性地表达下降，可以作为一个候选肺癌抑制基因;gPc3表达水平在吸烟者的肺癌 组织中的下降比不吸烟者显着;卯c3表达水平在NSCLC大肿瘤中的下调比小肿瘤显 着。实时荧光PCR能实时监测对应于特定基因模板量的荧光值，可以精确获知某一组 织中某一基因的含量，为定量研究基因的表达提供了新的技术平台。 第三部分组织芯片技术结合免疫组化检测NSCLC中GPC3蛋白的表达 研究表明细胞内gPc3转录后，在粗面内质网合成GPc3蛋白质前体，去处c末端 信号肤后接上GPI锚，转运至高尔基体，共价结合糖胺多糖链(GAG)后，进行硫酸肝 素化修饰，最终以分泌性囊泡形式转移到细胞膜表面，通过GPI锚固定在细胞膜表面。 目的检测GPC3蛋白在NSCLC中的表达情况。方法将25例NSCLC癌组织和癌旁正常 肺组织制作成组织芯片，进行免疫组织化学染色分析。结果几十个组织标本集中在一 张玻片上，组织微阵列排列整齐，点阵布局、间距和密度合适，玻片结合大部分紧密， 能够用于常规染色诊断及后续相关处理;GPC3蛋白主要集中分布在癌旁正常肺组织细 胞的胞膜上，呈弥散型分布在细胞表面，胞浆内也有少量散在分布;在肺癌细胞的胞 浆中也可见很少量蛋白颗粒，在胞膜上几乎没有。结论GPC3蛋白是一种细胞膜蛋白， 常二二军医大学博创卜学位论文中文摘蚕胸心外科学专业 其在NSCLC癌细胞和癌旁正常肺组织细胞上的表达差异与即c3基因在NsCLc中的 表达相一致。?