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表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗多囊肾病的实验研究

李林  
【摘要】:常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是最常见的威胁人类健康与生命的遗传性肾病,发病率约为1‰-2‰。ADPKD特征为肾脏及全身多个器官形成多个大小不等的液性囊肿,最终导致肾功能衰竭。然而至今人类对多囊肾病仍束手无策,缺乏监测疾病进展的敏感方法,亦无有效的治疗药物。据统计,美国每年用于多囊肾病治疗及护理的费用约为60亿美元。因此无论从科学价值、社会效益,还是经济效益来看,研究多囊肾病治疗药物均具有重大意义。 随着多囊肾病发病机制研究逐步深入,针对疾病发病机制中关键步骤,纠正病理生理异常,成为目前切实可行的治疗及干预方法。ADPKD是一种类似良性肿瘤的增生性疾病,与肿瘤一样,多种生长因子参与了囊肿起源及增大的过程。研究者从肿瘤的治疗中获得启示,设想抗肿瘤药可能对多囊肾病也具有治疗作用。这一假设于2000年获得了证实,Sweeney等报道表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂对常染色体隐性多囊肾病小鼠具有治疗作用。 从2000年起,我们课题组就开始了表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗常染色体显性多囊肾病的研究,力图开发出我国乃至世界上第一个多囊肾病治疗药物。本研究是该课题的重要组成部分,由四部分内容组成。 一、表皮生长因子及表皮生长因子受体在多囊肾病发病过程中的作用 研究表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗常染色体显性多囊肾病的安全性和有效性,首先要明确表皮生长因子及表皮生长因子受体(EGF/EGFR)在多囊肾病发病过程中的作用。研究分别以人囊肿衬里上皮细胞、ADPKD的Han:SPRD大鼠模型和多囊肾病患者为研究对象。采用原位杂交和免疫组织化学方法研究EGF和EGFR在多囊肾病大鼠以及ADPKD患者肾组织中的定位,Western blot定量检测EGFR和磷酸化EGFR在以上组织中的表达。ELISA检测囊肿衬里上皮细胞培养上清、多囊肾病大鼠和患者体液中EGF含量。MTT法检测rhEGF和多囊肾病患者囊肿对囊肿衬里上皮细胞增殖的影响,对相关的细胞信号转导机制进行了初步探讨。细胞水平和组织水平的研究都证实多囊肾病时存在EGF、EGFR质和量的异常:EGF表达位置不变,主要分布于远端小管的腔膜 第二军医大学博士学位论文(’肾脏病学) 摘要 面。虽然多囊肾组织EGF表达量较正常减少(尸0.05),但囊肿衬里上皮细胞能 分泌EGF,因此多囊肾病患者囊肿液内含有促分裂浓度(103.56p留ml)的EGF; 而多囊肾病患者与患病大鼠肾脏EGFR表达明显上调(尸丈0.05),使囊肿细胞对 EGF的促增殖作用较正常细胞更为敏感,且EGFR除表达于近端色肾小管上皮 细胞基底膜面外,还错位表达在囊肿衬里上皮细胞的腔膜面。腔膜面错位表达的 EGFR与囊肿液中相应配体直接结合,通过自分泌、旁分泌途径激活了受体胞内 的酪氨酸激酶,受体自身磷酸化后将增殖信号转导至细胞核,促进核因子c一fos、 c-jun表达,最终导致囊肿细胞显著增殖(P0.001),囊肿不断长大。本研究证 实了EGF/E GFR在多囊肾病发病过程中的重要作用,因此异常的EGFR可以作 为治疗多囊肾病的有效靶点。 二、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的分子对接及其作用机制研究 根据异常EGFR的致病作用,我们拟采用小分子酪氨酸激酶抑制剂治疗多 囊肾病。酪氨酸激酶抑制剂作为新兴的抗肿瘤药物,化学结构多样、作用机理各 异。我们采用计算机辅助药物设计技术对部分EGFR酪氨酸激酶抑制剂与激酶进 行分子对接,比较对接结果(△G)与实验结果(局)。采用LIGPLOT分析研 究抑制剂与酪氨酸激酶的结合方式和相互作用,探讨其抑制作用的分子机制。研 究结果显示△G与几具有高度相关性(产=0.925),证实了分子对接模型的可 靠性。研究同时还分析了酪氨酸激酶抑制剂的构效关系,为下一步的抑制剂结构 改造提供了线索。结果证实新型氨基哇哇琳类不可逆性抑制剂CZ一SIMM一001具 有很强的活性,因此我们将以CZ一SIMM一001作为下一步的实验药物。 三、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂筛选模型的建立和抑制剂的筛选 药物筛选是新药研究中最关键的步骤之一,其中分子水平的药物筛选模型 是药物的常规初筛工具,需要我们获取大量具生物学活性的酪氨酸激酶作为药物 筛选的靶蛋白。本部分研究通过基因工程技术成功地将933bP的EGFR一RTK cDNA片段插入表达载体pQE30中,构建了表达载体pQE30一RTK,在原核表达 系统中以包涵体形式表达了相当于EGFR胞内第684~第994位氨基酸(RTK片 段)的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的91.2%。变性的RTK蛋白经复性、 纯化后显示了良好生物学活性。将表达的蛋白偶联至生物芯片,应用表面等离子 共振原理,建立了分子水平表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的筛选模型。用 第二军医大学博士学位论文(肾脏病学) 摘要 该模型筛选31个化合物,发现了6个具有活性的化合物。该模型的建立大大提 高了药物筛选的效率和成功率,为发现新型酪氨酸激酶抑制剂奠定了基础。 四、酪氨酸激酶抑制剂CZ-s1MM.001的合成及治疗多囊肾病的实验研究 我们选取了EGFR酪氨酸激酶抑制剂CZ一SIMM一001进行治疗多囊肾病的体 内、体外实验。首先


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