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缺血预适应对体外循环中心肌细胞凋亡的影响及其膜蛋白分子机理研究

何斌  
【摘要】:本实验课题在建立了稳定 可靠的猫体外循环 CPB 动物模型的基础上 借助电 子顺磁共振仪 原子吸收光谱法 冷冻蚀刻电镜 流式细胞仪等较为新颖 科学性强的 测试仪器和手段 从多侧面动态研究 CPB 过程中缺血预适应 IPC 对心肌细胞膜蛋白 成份 构象 旋转及运动 以及细胞内信号转导的影响 并从多层次探讨 IPC 对心肌 细胞凋亡的各种生化特征和时程特点的影响 从细胞凋亡这一崭新角度阐述 IPC 对 CPB 中心肌细胞缺血再灌注 IR 损伤的保护作用 本实验研究共分为四个部分 主要研究方法和结果如下 一 缺血预适应动物模型的建立 心功能监测及心肌病理学研究 一 动物模型的建立和标本采集 将 90 只健康成年猫随机均分为 3 组 对照组 n 30 仅作单纯的并行 CPB 升主动脉不阻断 心脏不停搏 IR 组 n 30 于 CPB 开始 45 min 后阻断升主动脉 ACC 并采用间断顺行灌注冷晶体心脏停搏液行心 肌保护 ACC 60 min 后开放主动脉使心肌恢复再灌注 RP 辅助循环 30 min 后撤除 CPB 继续观测 60 min IPC 组 n 30于 ACC 前先进行 IPC 干预 ACC 5 min RP 10 min 并重复 3 次 余处理与 IR 组相同 IR 组和 IPC 组分别于 CPB 前 ACC 30 和 60 min RP 30 60 和 90 min 切取猫左心室心肌组织 对照组则在相对应时间点取材 采用多道生物信号分析系统动态观测心功能变化 采用 HBFP 特殊染色法 显示心肌组 织缺血 缺氧改变 和 GCA 特殊染色法 显示心肌组织变性 坏死改变 和以及透射 电镜分别观察 IPC 对心肌病理改变特别是超微结构变化的影响 二 结果 IPC 可减轻 CPB 中心肌细胞病理损伤并有利于 RP 期间心功能的恢复 二 缺血预适应对体外循环中心肌细胞膜蛋白结构及功能改变的影响 一 细胞膜蛋白组分的变化 采用 SDS-PAGE 蛋白电泳和冷冻蚀刻电镜观察 IR 组和 IPC 组在 ACC 和 RP 早期 分子量 18 KDa 以下的蛋白条带染色强度明显减少甚至几乎消失 但 IPC 组在 RP 90 min 时间点 在蛋白分子量约 18 KDa 以下的蛋白条带有恢复迹象 在各时间点各组膜蛋白 颗粒等效直径无明显统计学差异 断裂面两侧膜蛋白颗粒分布不对称 P 面多于 E 面 2 WP=7 第二军医大学 中文摘要 博士学位论文 IR 组和 IPC 组单位面积膜蛋白颗粒计数在 ACC 后明显减少 并于 RP 早期进一步减少 P0.05 但 IPC 组在 RP 30 min 时间点单位面积膜蛋白颗粒计数优于 IR 组 P0.05 随着 RP 时间的延长 IR 组和 IPC 组单位面积膜蛋白颗粒计数均出现不同程度的增多 二 细胞膜蛋白构象 运动特性和功能的变化 1 采用电子顺磁共振法测定心肌细胞膜蛋白巯基强/弱固定相峰高比值 hS / hW 和膜蛋白旋转相关时间 c 的动态变化 IR 组和 IPC 组 hS/ hW和 在 ACC 期间明 c 显升高 并于心肌RP早期进一步上升 但IPC组hS/ hW和 均明显低于IR组 P 0.05 c 随后 IR 组和 IPC 组 hS/ hW和 均有不同程度的回落 c 2 采用定磷法测定心肌细胞膜上两种重要的膜蛋白 Na -K ATPase 和 Ca2 -Mg2 ATPase 活性变化 ACC 期间 IR 组和 IPC 组心肌细胞膜 Na -K ATPase 和 Ca2 -Mg2 ATPase活性均显著下降 P0.05 RP早期 IR组和IPC组细胞膜Na -K ATPase 和 Ca2 -Mg2 ATPase 活性均进一步下降, 但 IPC 组优于 IR 组 P0.05 三 心肌组织中氧自由基含量的变化 氧自由基含量采用电子自旋共振 ESR 直接测定 IR 组氧自由基水平在 ACC 期 间出现上升趋势 并于 RP 30 min 时呈爆发性上升 P0.01 此后开始下降 至 RP 90 min 时已基本恢复正常 IPC 组氧自由基水平明显低于 IR 组 三 缺血预适应对体外循环中细胞内信号转导的影响 一 细胞膜通透性变化的研究 采用镧示踪法观察 IR 组和 IPC 组在 ACC 早期镧颗粒即出现于心肌细胞内 且随 着 ACC 时间的延长而逐渐增多并进入心肌细胞线粒体中 RP 早期 胞浆和线粒体内镧 颗粒流入明显加快 但 IPC 组升高幅度明显低于 IR 组 镧颗粒面密度比较显示两组间 存在显著统计学差异 二 细胞内 Ca2+含量的变化 采用透射电镜结合细胞化学法观察心肌细胞内 Ca2+分布的变化并采用原子吸收光 谱法定量测定 细胞内 Ca2+沉淀主要聚集在线粒体 IR 组和 IPC 组在 ACC 期间心肌细 胞内 Ca2 浓度轻度升高 RP 早期 IR 组和 IPC 组心肌细胞内 Ca2 含量均显著升高 至 RP 60 min 细胞内 Ca2 含量升高更加明显 但 IPC 组少于 IR 组 P0.05 随后 IR 组 和 IPC 组细胞内 Ca2 含量均逐渐恢复 三 蛋白激酶 C PKC 的活化和易位 采用 Inoguchi 方法制备心肌细胞膜和胞浆 PKC 采用底物蛋白磷酸化法测定 PKC 3 WP=8 第二军医大学 中文摘要 博士学位论文 活性 IR 组在 ACC 及 RP 期间胞膜和胞浆中 PKC 活性均明显降低 P0.05


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