携带野生型PTEN基因的重组腺病毒（Ad-PTEN）治疗子宫内膜癌的实验研究

【摘要】：子宫内膜癌是女性生殖道常见恶性肿瘤之一,近 20 余年来,发病率逐年升 高。尽管 70%子宫内膜癌患者就诊时是临床Ⅰ期,预后较好,但是对于晚期病人 仍然没有很好的治疗办法,化疗、放疗反应率大大降低,其中对激素治疗的反应 率约为 25%,化疗的反应率为 28%,五年生存率仅 10.6%～30%。此外,子宫内 膜癌约有 10%的患者发生于绝经前,其中有部分患者年龄较轻、尚未生育,且年 轻患者比例有增加趋势,文献报道小于 40 岁者所占比例已由 1%～8%增至 13.3%。随着人们对生活质量的要求逐渐提高,对年轻子宫内膜癌患者保留生育 与生理功能的治疗亦日渐受到重视。近 10 余年来,由于分子生物学的迅速发展, 肿瘤基因治疗逐步从实验室进入临床。PTEN 是一种肿瘤抑制基因,位于第 10 号染色体上 10q23.3, 编码一多功能磷酸酶,已证实在人类许多恶性肿瘤中存在 突变。PTEN 基因在子宫内膜癌中的突变是所有恶性肿瘤中检出率最高的,也是 至今为止在子宫内膜癌中鉴定出的最为常见的基因突变事件。PTEN 基因的突变 常常发生在早期(Stage Ⅰ/GradeⅠ),但也发生在非常晚期且具有高度侵蚀性的 子宫内膜肿瘤(Stage Ⅳ/GradeⅢ)中,且与晚期子宫内膜癌患者术后化疗敏感 性、生存率有着密切的关系。基因治疗作为继肿瘤的手术治疗、化疗、放疗之外 的第四种治疗方法,越来越受到人们的关注,补充功能丢失的抑癌基因,增强肿 瘤细胞对放、化疗的敏感性是治疗恶性肿瘤的一个重要策略。本研究的目的是构 建携带野生型 PTEN 基因的腺病毒(Ad-PTEN),体外、体内转染该基因突变的 子宫内膜癌 RL95-2 细胞,观察其对子宫内膜癌细胞增殖抑制、凋亡诱导作用及 其机理;应用裸鼠动物模型,ex vivo 观察其对 RL95-2 细胞裸鼠致瘤性的影响, in vivo 观察体内基因治疗效果,以及基因治疗后肿瘤组织内相关基因、蛋白、 雌孕激素受体表达的改变,旨在为子宫内膜癌的基因治疗进行一些有益的尝试, 并提供有一定意义的实验数据。本研究分为以下三部分: 1.携带野生型 PTEN 基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)的构建及制备 4 WP=7 第二军医大学 中文摘要 博士学位论文 用限制性内切酶 KpnⅠ、XhoⅠ将 PTEN cDNA 自 pcDNA3.0 PTEN cDNA 质粒中 酶切下来,由 T4 DNA ligase 联接到穿梭载体 pShuttle-CMV 上。再用穿梭质粒 pShuttle-CMV-PTEN cDNA PmeⅠ酶切、去磷酸化,然后与质粒 pAdeasy-1 一起 电穿孔进入大肠杆菌 BJ5183,进行同源重组制备重组腺病毒载体质粒 pAdeasy-PTEN cDNA。PacⅠ酶切质粒 pAdeasy-PTEN cDNA,胶回收后获得的腺病 毒基因组 DNA,再用脂质体转染的方式转染 HEK293 细胞(腺病毒包装细胞),产 生复制缺陷型重组腺病毒 Ad-PTEN,经基因测序及 PCR 鉴定,扩增病毒并测定病 毒滴度。 重组质粒 pShuttle-CMV-PTEN cDNA 经双酶切和 DNA 序列测定鉴定证实,野 生型 PTEN cDNA 片段序列以正确方向插入穿梭载体。经 PacⅠ酶切和 DNA 序列分 析证实,穿梭质粒 pShuttle-CMV-PTEN cDNA 与腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1 在大 肠杆菌 BJ5183 中成功发生同源重组,产生重组腺病毒载体 pAdeasy-PTEN cDNA。 重组腺病毒载体转染 HEK293 细胞 7～10 天后可见细胞变圆、肿胀,呈葡萄串状、 并有少量浮起等细胞病变现象(CPE)。此时收集细胞重悬于 PBS 中,经三次反复 冻融获得的上清中含有大量重组腺病毒颗粒 Ad-PTEN。重组腺病毒的鉴定:PTEN cDNA 重组腺病毒基因组 DNA 为模板的 PCR 产物具有预期的分子量大小,提示重 组腺病毒基因组 DNA 具有 PTEN cDNA 序列。提取重组腺病毒 Ad-PTEN 感染的 RL95-2 细胞总 RNA 进行 RT-PCR,结果提示,该重组腺病毒感染后的宿主细胞具 有 PTEN cDNA 对应的 mRNA 表达;western-blot 方法鉴定 PTEN 蛋白 在 RL95-2 细胞中有表达。TCID50法测定重组腺病毒 Ad-PTEN 的滴度为 5×109pfu/ml。 2.携带野生型 PTEN 基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)抑制子宫内膜癌细胞增 殖的体外实验研究 体外转染 Ad-PTEN 于 PTEN 基因突变的子宫内膜腺癌 RL95-2 细胞,以 LacZ 作为报告基因,X-gal 染色检测转染效率。应用光镜、透射电镜观察外源性 PTEN 基因表达对 RL95-2 细胞形态学及超微结构的影响;应用 RT-PCR、Western blot、 细胞免疫组化检测Ad-PTEN在RL95-2细胞中的转录及表达; 应用细胞计数、MTT 实验,观察 Ad-PTEN 对 RL95-2 细胞生长抑制作用;应用流式细胞分析仪(FCM) 检测 Ad-PTEN 对 RL95-2 细胞周期分布的影响;应用 FCM 检测 Ad-PTEN 诱导 RL95-2 细胞凋亡的作用,包括核 DNA 片段化实验(DNA ladder),Casapase-3 检测,细胞膜 PS 外翻实验。 5 WP=8 第二军医大学 中文摘要 博士学位论文 HE 染色光镜下可见,转染空载体及对照组 RL95-2 细胞成片生长,胞浆舒展, 核分裂像多见;转染 Ad-PTEN 24 小时,可见 RL95-2 细胞缩小变圆,从成群细 胞中脱落,易见凋亡小体。透射电镜发现,转染空载体及对照组细胞膜表面见微 绒毛突起,细胞核内异染色质呈细颗粒状,弥散分布,而经 Ad-PTEN 转染后 48h,RL95-2 细胞出现典型凋亡形态