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Ⅰ型磷酸酶的新型抑制亚基(IPP2)的抗肿瘤作用及其机制研究

曾麒燕  
【摘要】:蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着重要生命活动的所有过程,包括细胞增殖、分化、发育、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢、肿瘤发生,而且蛋白磷酸化也是胞浆内信息和核内信息调控的必经环节。过去对蛋白质可逆性磷酸化的研究主要集中在蛋白激酶(protrin kinase,PK)的调控方面。现在认为蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)和PK一样受到严密调控,同样起重要的作用。 Ⅰ型蛋白磷酸酶(PP1),通过去磷酸化蛋白调节机体代谢、细胞分化以及信号转导等。它由催化亚基和调节亚基组成,后者决定磷酸酶的底物特异性,活性以及亚细胞定位。目前已发现多个PP1的抑制蛋白,其中Ⅰ型磷酸酶抑制因子(IPP1)是第一个发现调节蛋白磷酸酶活性的内源性分子,它特异性抑制Ⅰ型磷酸酶活性,在骨骼肌、脑、脂肪组织、肾脏等高表达。蛋白激酶A(PKA)磷酸化IPP1的35位苏氨酸,为IPP1发挥其抑制磷酸酶的功能所必须,引起广泛的细胞应答如影响细胞周期、基因表达、糖代谢以及脂类代谢、突触可塑性等。可见,IPP把蛋白激酶和蛋白磷酸酶连接起来,调节细胞的信号转导。 免疫组化表明在肝癌细胞、恶性成骨瘤和软组织瘤,骨肉瘤、恶性皮肤纤维瘤、脂肪肉瘤中,PP1表达上调,PP1活性也随之升高,表明PP1的过表达可加速恶性肿瘤的生长。而用PP1的抑制剂冈田酸和花萼海绵诱癌素A可增强TNF诱导的凋亡并引起PP1、PP2A羧基末端修饰如去甲基化;周期肽nodularin和微囊藻素LR可诱导人乳腺癌细胞MEF—7以caspase-3依赖的方式凋亡。PP1与细胞周期的关系较为密切:在G1期和S期,PP1存在于胞浆;在G2期则部分向核内聚集;在M期与染色体紧密结合并能促进有丝分裂的完成。PP1基因的突变、反义寡核苷酸或PP1的抑制剂可通过影响纺锤体组装,诱导有丝分裂停滞而延迟有丝分裂进程;或使染色体过度凝集导致姊妹染色体分离异常最终导致多倍体生成而抑制细胞生长。表明PP1、PP2A可维持正常的有丝分裂。 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 我们利用cDNA文库大规模测序和EST同源比较的方法,从正常人骨髓 基质细胞中分离到一种新型全长基因,全长为1637bp,含348bp编码区,编 码116个氨基酸,与其他分子的同源性比较,提示其可能属于I型磷酸酶的抑 制亚基Ippl(inhibitor of protein pho印hatasel)家族,尤其在N端功能区与人 Ippl高度同源,因此将该新基因命名为IppZ(inhibitor ofprotein phosphataseZ)。 本课题以人宫颈癌细胞HeLa为实验模型,研究了IPPZ对其生长的影响, 并探讨其相关作用机制。具体包括:l)筛选稳定表达IPPZ的野生型和持续活化 型的HeLa细胞株;2)稳定表达IPPZ的野生型和持续活化型的HeLa细胞株的 增殖和迁移实验;并通过荷瘤裸鼠体内实验观察其对HeLa细胞生长的体内抑制 作用3)FACS分析其细胞周期的变化;4)利用W七stem blot和免疫共沉淀等方 法分析其细胞周期调控蛋白的变化5)进一步探讨了相关的信号传导途径。 我们构建了人野生型IPPZ真核表达载体(IPPZ/WT)和突变活化型IPPZ真 核表达载体(IPPZ/SHI一2)。该型为短片段持续活化型,编码第8一60位氨基酸, 其中第40位苏氨酸突变为天冬氨酸。 为了研究IPPZ对HeLa细胞生长的影响,我们将IPPZ的野生型、活化型及 对照空质粒分别转染HeLa细胞,获得稳定表达细胞株,Rl’- PCR及W七stem blot 证实其基因转染成功。利用3H一TdR掺入法、软琼脂克隆形成实验和迁移实验对 其生长、迁移能力进行分析,结果表明,与对照组相比,转染IPPZ活化型的HeLa 细胞(HeLa一IPPZ/S Hl一2)的生长受到显著抑制,其克隆形成能力和迁移能力均 显著下降。然后,观察了IPPZ在体内的抑瘤效果,将稳定转染的HeLa细胞在裸 鼠体内进行了致瘤性观察,结果表明,HeLa一I即2/SHI一2和HeLa一IPPZ/WT的致 瘤性明显下降,而且前者的抑瘤效果更显著。此外,应用在体电脉冲技术(i n vivo electroporation)将真核表达质粒进行裸鼠瘤体内基因导入,结果表明,IPPZ活化 型(IPPZ/SHI一2)基因治疗组的荷瘤裸鼠的生存期明显延长。表明,IPPZ对HeLa 细胞的生长具有体内外抑制作用. 为了阐明IPPZ对HeLa细胞的生长抑制作用的机制,本研究对工PPZ瞬时表 达和稳定表达的HeLa细胞均进行了细胞周期分析。结果表明IPPZ活化型 (IPPZ/SHI一2)的瞬时表达可导致HeLa细胞GZ/M期细胞比例升高。对IPPZ稳 定表达的HeLa细胞,我们首先采用血清饥饿法,分析恢复血清后的细胞周期的 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 进程。结果显示,在72小时内,HeLa-IPPZ/S Hl一2所经历的周期次数较其他组少, 而且从总的趋势看,HeLa一IPPZ/S Hl一2的G2/M期细胞比例升高(尤其在恢复血 清后的12小时内),S期比例降低。HeLa-IPPZ/WT在72小时内的周期次数介 于HeLa一IPPZ/SHI一2与对照组之间。表明IPPZ的活化型(IPPZ/SHI一2)和野生型 (IPPZ/WT)的稳定表达均可影响HeLa细胞的细胞周期进程,使细胞周期时间 延长,因而可导致HeLa细胞增殖缓慢,但前者对细胞周期进程的影响更强,因 而解释了在裸鼠的体内致瘤实验中IPPZ/S Hl一2的抑瘤作用更强的原因。此外由 于IPPZ/SHI一2的稳定表达还可使HeLa细胞的


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