收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

SARS-CoV结构蛋白的抗原性鉴定、DNA免疫与RNA干扰的研究

赵平  
【摘要】:2002年末始发于中国广东省的非典型肺炎(infectious atypical pneumonia,),随后也被称为严重急性呼吸综合征(The severe acute respiratory syndrome,SARS),具有高度传染性与致病性。疫情于2003年2月传播至香港,随后迅速向全球各地蔓延。其致病因子于2003年3月被鉴定为一种新的冠状病毒,被命名为SARS冠状病毒(SARS-CoV)。冠状病毒是一类球形、有包膜的病毒,基因组为长约30 kb的单股正链RNA,主要引起人和动物的呼吸道与肠道疾病。SARS-CoV的基因组结构为:5′-帽状结构-复制酶(rep)-刺突糖蛋白(S)-小包膜蛋白(E)-膜糖蛋白(M)-核衣壳蛋白(N)-polyA尾-3′。本研究用大肠杆菌表达出了SARS-CoV的结构蛋白及3CL~(pro)蛋白,检测了SARS恢复期患者血清中的抗体情况,构建了S与N蛋白的DNA疫苗,进行了小鼠免疫试验,并筛选出了数段可特异阻断S、N基因表达的小干扰RNA(siRNA)。该系列研究对于了解SARS-CoV的免疫学特点及为发展SARS-CoV感染的防治方法有一定参考意义。 一、SARS-CoV结构蛋白在大肠杆菌中的表达和对SARS恢复期血清中抗体的分析 扩增SARS-CoV的结构蛋白S、N、M、E蛋白基因与蛋白酶3CL~(pro)基因。其中S基因被分为4段分别扩增,S300(14~313 aa)、S240(301~540 aa)、S338(557~894 aa)和S324(867~1190 aa)。M基因另被分为两段分别扩增,MN(1~110aa)和MC(111~221 aa)。分别将这些基因片段插入原核表达质粒载体pPROEX HT、pBV220、pET21a与pGEX-4T-1,转化到合适的大肠杆菌,用IPTG或加热培养基的方法诱导目的基因的表达。菌体样品进行SDS-PAGE分析,随后用两份抗SARS-CoV IgG强阳性的SARS恢复期混合血清对表达产物进行Western Blot分析。结果表明,S300、S240、S338、S324、N、MC、E及3CL~(pro)表达质粒均可在大肠杆菌表达出与预测分子量一致的蛋白分子。其中,N蛋白与SARS恢复期血清的反应最强,S蛋白次之,四段S蛋白中,S300的反应最强,S240与S338的反应强度相似,随后为S324。MC蛋白的反应较弱,E、3CL~(pro)蛋白则未见明确的反应条带。该结果在一定程度说明,SARS-CoV的N蛋白具有强抗原性,随后则是S与M蛋白,而S蛋白的主要抗原决定簇位于该蛋白的氨基末端。 用Ni-NTA树脂分别纯化大肠杆菌表达的S300、S240与N蛋白,包被酶联板,以ELISA检测临床确诊的18份SARS患者恢复期血清,其中17份血清抗N蛋白IgG阳性,14份血清抗S300 IgG阳性,10份血清抗S240 IgG阳性。结果进一步表明,N、S蛋白对于SARS-CoV感染的诊断具有重要意义。由于S蛋白的中和抗体表位主要位于其氨基端,而S240是涉及SARS-CoV病毒体与其受体血管紧张素转化酶Ⅱ结合的关键多肽,因此,血清中S300、S240抗体的检测结果表明S蛋白体液免疫应答在SARS-CoV感染者存在不均一性,也提示S蛋白抗体在SARS恢复中的作用值得进一步研究。 二、S、N蛋白基因疫苗在小鼠的免疫试验 用哺乳动物优势密码子合成S基因1~751 nt,分别用绿色荧光蛋白表达质粒pEGFPN1为载体检测合成的序列与相应的野生序列的表达效率,结果表明密码子优化可明显提高该基因的表达水平。用PCR分别拼接、扩增得到S基因1~2058 nt的DNA片段和S基因1913~3768 第二军医大学博士学位论文 袱 ni的DNA片段,利用S基因第1924位的Sa几酶切位点,将两片段连接为3768ni的全长S 基因.再利用S基因第750ni的Pstl酶切位点,将合成的S基因1一75 Ini片段置换到全长S 基因中.将密码子部分优化的全长S基因插入真核表达质粒载体,构建成表达质粒 PCIDN一mFS。将该质粒肌肉注射接种BALB/c,卜鼠,剂量100林留只,二周一次,共3次。 分别以大肠杆菌重组5300、5240及SARS一 CoV全病毒抗原检测小鼠血清中的杭SARS一CoV IgG抗体。结果表明,S基因DNA疫苗能在小鼠有效诱导杭SARS一Cov IgG特异性抗体, 三次免疫后的小鼠杭体阳转率达75%。结果还发现,S蛋白不同区段多肤刺激的体液免疫应 答存在明显的异质性,提示诱导全面的S蛋白杭体是研究SARS疚苗需要关注的问题. 将N基因插入真核表达质粒载体pcl一ne。,得到重组表达质粒pCI一N,转染COsl细胞, 细胞裂解液进行westem Blot分析,表明该质粒能表达N蛋白.将质粒pcl一N肌肉注射接种 BALB/。小鼠,检测小鼠血清中的N蛋白IgG抗体,用重组N蛋白体外刺激小鼠脾细胞,检 测其增殖反应及分泌的细胞因子IFN一Y与IL一4.结果表明,N蛋白DNA疫苗可有效诱导特 异性杭体与T淋巴细胞免疫应答,脾细胞分泌的细胞因子及杭体亚类的分析还表明,N蛋白 诱导的免疫应答属于Thl型。结果提示,N蛋白是有效的T淋巴细胞免疚原,其诱生的细胞 免疫应答对于杭SARS一CoV复制及促进S等包膜蛋白的杭体反应可能均起重要作用,因此, 联合N蛋白可能提高SARS疫苗的保护效果. 三、杭SARS一COV小干扰RNA的筛选和功能鉴定 分别设计四段靶向N基因及两段靶向S基因的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA),用PCR合成编码小鼠U6 RNA聚合酶启动子调控的siRNA表达框架.将PCR合 成的siRNA表达框架与N及S一EGFP融合基因表达质粒共转染COSI细胞,观察细胞内绿 色荧光的变化。结果发现


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 汤鑫;万家余;鞠传静;李莎;郝镯;刘文森;李忠义;孟轲音;张晓晶;刘林娜;沈景林;马永和;钱军;;PrP(D178N)无细胞表达、抗原性及结构分析[J];中国生物制品学杂志;2011年09期
2 王迅;;输血可能传播的新发或再现传染病有哪些? 如何防控?[J];微生物与感染;2011年02期
3 肖光文;谢彦鹏;黄金文;;微生物学检验课程建设的实践与探索[J];检验医学与临床;2011年15期
4 徐明月;罗祖源;程小飞;林子乔;;甲型H1N1流感的X线及CT表现(附64例分析)[J];中国社区医师(医学专业);2011年23期
5 王选斌;;突发疫情的流行病学调查及相关处理[J];中国医药指南;2011年17期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈洪;;严重急性呼吸综合征41例临床分析[A];第十九届航天医学年会暨第二届航天护理年会论文汇编[C];2003年
2 管剑龙;韩星海;方勇飞;耿利;侯立朝;张健鹏;;严重急性呼吸综合征患者的肌肉损害[A];中华医学会全国风湿病学年会论文汇编[C];2003年
3 陈卫国;黄婵桃;贾铭;段刚;刘立文;陈大起;黄信华;;SARS的X线诊断(附120例报告)[A];2003年全国医学影像技术学术会议论文汇编[C];2003年
4 石玉玲;李林海;万卓越;徐德兴;;严重急性呼吸综合征患者血清特异性抗体变化规律研究[A];第十届全军检验医学学术会议论文汇编[C];2005年
5 杨运旗;孙兰英;张晶;蒋芸;;老年严重急性呼吸综合征24例临床分析[A];贵州省医学会内科学分会2007年学术年会专题讲座及论文汇编[C];2007年
6 邹水兰;王广发;张成;林琴;顾江;张瑛琪;;严重急性呼吸综合征肺组织中肿瘤坏死因子α的表达及意义[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年
7 杨伟康;刘翱;陈宇英;李妍;樊满齐;;41例传染性非典型肺炎的影像表现[A];第七次全国中西医结合呼吸病学术交流大会论文汇编(二)[C];2004年
8 张忠德;张瑜;欧爱华;唐光华;唐雪春;许银姬;冯维斌;林浩;刘慧;李咏文;;严重急性呼吸综合征(SARS)患者出院后生存质量的调查与分析[A];2005年全国危重病急救医学学术会议学术论文集[C];2005年
9 韩扬;谢静;李太生;戴懿;李雁凌;左玲艳;王爱霞;;62例严重急性呼吸综合征(SARS)患者血浆特异性IgG水平三年的动态变化[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年
10 耿进朝;李明山;戴金汉;;严重急性呼吸综合征(SARS)的影像学诊断[A];2003年全国医学影像技术学术会议论文汇编[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵平;SARS-CoV结构蛋白的抗原性鉴定、DNA免疫与RNA干扰的研究[D];第二军医大学;2004年
2 孙颖;SARS患者临床标本中脊髓灰质炎病毒及呼肠病毒的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
3 黑爱莲;严重急性呼吸综合征冠状病毒全基因组基因的克隆及SARS-Cov分子富集检测体系的研究[D];中国协和医科大学;2004年
4 陈云新;ACE2基因变异与SARS冠状病毒进入及肺部病变严重程度之间的关系研究[D];中国协和医科大学;2008年
5 王刚;SARS病毒RdRp基因的RNA干扰研究[D];四川大学;2006年
6 牛金亮;股骨骨髓的MRI研究[D];华中科技大学;2006年
7 王顺心;SARS-CoV Spike蛋白受体结合结构域在哺乳动物细胞中的表达、纯化及功能研究[D];中国协和医科大学;2007年
8 贺莉;SARS病原体原位检测及发病机制研究[D];第一军医大学;2006年
9 汤芳;SARS患者感染危险因素及其随访观察研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年
10 郑福英;牛流行热病毒糖蛋白G_1抗原表位的表达及重组G_1蛋白抗原间接ELISA方法的建立[D];中国农业科学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 梁秋丽;血清特异性抗体检测在严重急性呼吸综合征诊断中的意义[D];广西医科大学;2004年
2 彭丹冰;长春市34例SARS病例流行病学分析[D];吉林大学;2004年
3 宋晓慧;山西省中西医结合治疗SARS临床回顾性研究[D];山西医科大学;2004年
4 柯金山;SARS-CoV结构蛋白的表达、抗原性鉴定和DNA免疫研究[D];第二军医大学;2004年
5 张国强;自身淬灭荧光定量PCR检测SARS冠状病毒方法的建立[D];重庆医科大学;2005年
6 何冰;中医药对SARS患者恢复期肺功能、肺结构的影响及生存质量评估[D];北京中医药大学;2004年
7 袁娴芬;SARS冠状病毒S基因片段保守性高抗原性C区基因DNA疫苗的免疫学特性研究[D];武汉大学;2004年
8 胡庆平;61例SARS住院病人的中医证候特征[D];广州中医药大学;2007年
9 楚心唯;SARS临床诊断病例的流行病学研究[D];第一军医大学;2004年
10 汪萍;SARS治疗一线医护人员心理健康状况调查及危机干预模式构建的研究[D];第四军医大学;2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;严重急性呼吸综合征临床表现[N];农村医药报(汉);2007年
2 ;严重急性呼吸综合征的治疗[N];农村医药报(汉);2007年
3 程峰;中西医结合治疗严重急性呼吸综合征临床疗效评价研究获奖[N];科技日报;2005年
4 ;严重急性呼吸综合征的诊断标准[N];农村医药报(汉);2007年
5 江南雪舞;像皇冠一样的冠状病毒[N];大众卫生报;2005年
6 全国科技名词审定委员会 樊静;“非典”改名是时候了[N];科技日报;2004年
7 罗刚;多方面免疫损伤是SARS重要发病机理[N];健康报;2007年
8 ;什么是SARS?[N];新华每日电讯;2003年
9 胥金章 黄显斌;“非典”护理:瞄准ISO9001[N];中国医药报;2003年
10 方飞 林乾;WHO关于SARS标本处理的指南[N];中国医药报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978